Summary
该方案展示了一种独特的窒息性心脏骤停小鼠模型，该模型不需要胸外按压进行复苏。该模型可用于监测和成像心脏骤停和复苏期间的大脑生理动力学。
Abstract
大多数心脏骤停 （CA） 幸存者会出现不同程度的神经功能缺损。为了了解支撑 CA 诱导的脑损伤的机制并随后开发有效的治疗方法，实验性 CA 研究至关重要。为此，已经建立了一些小鼠CA模型。在大多数这些模型中，将小鼠置于仰卧位，以便进行胸外按压以进行心肺复苏（CPR）。然而，这种复苏程序使得 CA 和复苏期间大脑生理学的实时成像/监测具有挑战性。为了获得这些关键知识，本方案提出了一种不需要胸外按压CPR步骤的小鼠窒息CA模型。该模型可以研究血流、血管结构、电位和脑组织氧的动态变化，从 CA 前基线到 CA 再灌注后早期。重要的是，该模型适用于老年小鼠。因此，该小鼠CA模型有望成为破译CA对大脑生理学影响的关键工具。
Introduction
心脏骤停 （CA） 仍是一场全球公共卫生危机1.仅在美国，每年就报告超过 356,000 例院外 CA 病例和 290,000 例住院 CA 病例，大多数 CA 患者年龄超过 60 岁。值得注意的是，冠状动脉后神经损伤在幸存者中很常见，这对冠状动脉管理构成了重大挑战2,3,4,5。为了了解 CA 后脑病理变化及其对神经系统结果的影响，已在患者6、7、8、9、10、11、12 中应用了各种神经生理学监测和脑组织监测技术。使用近红外光谱，还对 CA 大鼠进行了实时脑部监测，以预测神经系统结果13。
然而，在小鼠 CA 模型中，由于需要胸外按压以恢复自发循环，这种成像方法变得复杂，这总是需要大量的身体运动，因此阻碍了精细的成像程序。此外，CA模型通常在小鼠仰卧位的情况下进行，而对于许多脑成像方式，小鼠必须转向俯卧位。因此，在许多情况下，需要在手术过程中具有最小身体运动的小鼠模型，以便在从CA前到复苏后的整个CA过程中对大脑进行实时成像/监测。
此前，Zhang 等人报道了一种可用于脑成像的小鼠 CA 模型14。在他们的模型中，CA是通过推注维库溴铵和艾司洛尔诱导的，然后停止机械通气。他们表明，在CA5分钟后，可以通过输注复苏混合物来实现复苏。然而，值得注意的是，在他们的模型中，循环停滞仅发生在艾司洛尔注射后约 10 秒。因此，该模型没有概括患者窒息诱导的 CA 的进展，包括逮捕前期间的高碳酸血症和组织缺氧。
目前外科手术的总体目标是模拟小鼠的临床窒息性CA，然后在没有胸外按压的情况下进行复苏。因此，该 CA 模型允许使用复杂的成像技术来研究小鼠的大脑生理学15。
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Protocol
这里描述的所有程序都是根据美国国立卫生研究院 （NIH） 关于在研究中护理和使用动物的指南进行的，并且该协议已获得杜克大学动物护理和使用委员会研究所 （IACUC） 的批准。本研究采用8-10周龄的C57BL/6雄性和雌性小鼠。
1. 手术准备
- 在数字秤上称量小鼠，并将其放入 4 英寸 x 4 英寸 x 7 英寸的有机玻璃麻醉诱导盒中。
- 将麻醉汽化器调整为5%异氟烷，氧气流量计调整至30，氮气流量计调整至70（见 材料表）。
- 将动物从诱导箱中取出，当其呼吸频率降至每分钟30-40次呼吸时，将其仰卧在手术台上。
- 用钝镊子拉出舌头，用非惯用手握住舌头。用惯用手将喉镜（见 材料表）插入鼠标的嘴里，观察声带。
- 用非惯用手将导丝和 20 G 静脉导管插入口腔。轻轻地将导丝插入气管。
- 将导管推入气管，直到导管的翼部与鼻尖齐平。
注意：不要给未完全麻醉的小鼠插管，因为这可能会损伤气管并导致气道出血。 - 将插管的小鼠连接到小动物呼吸机（见 材料表），并将异氟醚降至1.5%。
- 将鼠标的体重输入呼吸机的控制面板，以确定潮气量和呼吸频率。
- 在加热灯下保持鼠标仰卧位，并用温度控制器将直肠温度保持在 37 °C。
- 剃除腹股沟区域，用碘和酒精对手术区域进行至少三次消毒（见 材料表），并用无菌手术单覆盖该区域。
- 在双眼上涂抹眼药膏，并在手术前皮下注射 5 mg/kg 卡洛芬。
- 打开无菌器械包装进行手术。用手术剪刀做一个 1 厘米的皮肤切口，以进入两侧的股动脉。用单股4-0丝线缝合线解剖并结扎股动脉远端（见材料表），并应用一滴利多卡因。
- 在股动脉近端应用动脉瘤夹，并在夹子远端的动脉上做一个小切口。将聚乙烯 10（PE-10，参见 材料表）导管插入左右股动脉。
注意：左动脉管用于血压监测，而右动脉管用于抽血和复苏混合物输注。 - 将 50 μL 1：10 肝素化盐水注射到每条动脉管路中，以防止管路凝血。
- 将鼠标转到俯卧位，并将其安装在立体定位头架上。
- 将三个针电极（红色、绿色和黑色）连接到左臂、左腿和右臂进行心电图（ECG，见 材料表）监测。
- 通过0.5厘米的皮肤切口将柔性塑料纤维探针粘在完整的颞颅骨上，用于脑血流监测。此步骤是可选的。
- 剃掉头顶，用碘和酒精对手术区域进行至少三次消毒，并用无菌手术帷幔覆盖该区域。
- 切开一个2.5厘米的中线皮肤切口，用四个小牵开器暴露整个颅骨表面进行脑成像。
- 在头顶上方放置一个监测成像仪（例如，激光散斑对比成像仪，见 材料表）。
注意：可以在颅骨表面添加几滴生理盐水，以促进激光散斑对比成像。
2. 诱发心脏骤停
- 用 26 μL 复苏混合物储备液填充 1 mL 塑料注射器。
注：每毫升该溶液含有 400 μL 1 mg/mL 肾上腺素、500 μL 8.4% 碳酸氢钠、50 μL 1,000 U/mL 肝素和 50 μL 0.9% 氯化钠（参见 材料表）。 - 等到体温达到37°C。 将氧气计调整至100%，使血液充氧2分钟。
- 通过右股动脉将含氧动脉血抽取至200μL的塑料注射器中，该注射器含有26μL复苏混合物储备溶液。
- 关闭氧气，将氮气增加到100%以引起缺氧。
注意：大约 45 秒后，心脏将无法正常工作，心率将迅速下降，表明 CA 发作。缺氧约 2 分钟后，心电图监测将提示心脏停搏，并且不会有可测量的全身血压和可忽略不计的脑血流量。 - 关闭呼吸机、异氟烷汽化器、温度控制器和氮气流量计。将氧气调节至100%，为复苏做准备。
3. 复苏程序
- 在 CA 发作后 8 分钟打开呼吸机。
- 立即开始在1分钟内 通过 右股动脉将抽出的含氧血液与复苏混合物混合到血液循环中。
注意：输注导致心率逐渐增加和血液灌注恢复;最终，实现了自主循环（ROSC）的恢复。
4. CA 后恢复
- 将鼠标从立体定位框架中取出后置于仰卧位，并从股动脉中取出PE-10导管。
- 将0.25%布比卡因涂在皮肤切口上，并使用6-0尼龙缝合线缝合皮肤切口（见 材料表）。将抗生素软膏涂抹在皮肤切口表面。
- 当自主呼吸恢复时，断开鼠标呼吸机。
- 将鼠标转移到温度控制为32°C的恢复室中。
- 恢复2小时后，拔管小鼠，并返回家笼。皮下注射 0.5 mL 生理盐水以防止脱水。
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Representative Results
为了诱导CA，用1.5%异氟烷麻醉小鼠，并用100%氮气通气。这种情况导致 45 秒内出现严重的心动过缓（图 1）。缺氧2分钟后，心率急剧降低（图2），血压降至20mmHg以下，脑血流完全停止（图1）。当异氟醚被关闭时，体温不再被控制，并在CA结束时缓慢下降到约32°C（图1）。
CA 8 分钟后，立即打开呼吸机，并为小鼠提供 100% 氧气。血液复苏混合物 通过 动脉导管输注到循环中。注射血液复苏混合物后不久，心脏功能开始恢复。短暂的间隔后，恢复全身和脑血流，建立ROSC。在我们的实验室中，ROSC的成功率几乎是100%。该模型已在年轻和老年小鼠中成功进行。
在该模型的支持下，本研究使用了两种成像方式，包括激光散斑对比成像（LSCI）和光声成像，以监测CA和复苏期间全脑水平的脑血流量和血氧。LSCI证实在CA期间大脑中完全没有血流（图3）。CA手术过程中血流、结构和氧合的更详细变化可以从光声图像中获得（图4）。
图 1：CA 和复苏期间的生理记录。 脑血流量（% 基线;通过激光多普勒血流测量）、血压 （mmHg）、心脏活动（每分钟心跳次数）和体温 （°C） 在 CA 之前、CA 期间和 CA 之后发生变化。x 轴以分钟为单位描述时间。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：CA 和复苏期间的心脏活动。 连续记录心率，图 （A）、（B） 和 （C） 分别代表 CA 前、CA 期间和 CA 后的心率。y 轴表示绝对电压值 （mV）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：CA 和复苏期间的激光散斑对比图像。监测整体脑血流。与基线 （A） 相比，CA 导致脑血流 （B） 完全丧失。复苏后立即在大脑中出现过度灌注（C），然后在晚期（D）进行低灌注。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：CA 和复苏期间的光声图像。使用光声成像访问局部血管变化。与基线 （A） 相比，在 CA （B） 期间动脉和分支未灌注血液。复苏后立即灌注所有动脉和分支，甚至包括分支之间的一些微小桥（C，箭头）。然而，由于灌注不足，这些桥在晚期（D）消失。条形图显示 sO2 水平。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在实验性 CA 研究中，窒息、氯化钾注射或电流衍生的心室颤动已被用于诱导 CA 16、17、18、19、20、21、22、23。通常，在这些 CA 模型中，复苏需要心肺复苏术，尤其是在小鼠中。我们配制了一种复苏混合物，可在小鼠窒息后进行自发复苏。取消心肺复苏步骤为在冠状动脉和使用当前成像方式复苏期间监测脑生理学提供了更多机会。
这种复苏混合物原液包括碳酸氢钠、肝素、含氧动脉血和肾上腺素。众所周知，冠状动脉可诱发代谢性酸中毒和呼吸性酸中毒。碳酸氢钠有望使血液中的pH值正常化。肝素是一种抗凝剂，用于防止再灌注过程中形成有害凝块。在该模型中，含氧血液和肾上腺素是复苏最关键的成分。虽然支撑这种自发复苏的确切机制仍然未知，但据推测，当足够量的含氧血液到达冠状动脉，从而输送氧气和肾上腺素时，可以在没有胸外按压的情况下恢复心肌收缩力和产生心输出量。在这个过程中，输注压力至关重要，因为这有利于将含氧血液输送到心脏，这只有在未塌陷和较厚壁的动脉血管系统中才能实现。为了支持这一观点，我们发现 通过 股静脉输注相同的混合物不会导致心脏功能的恢复，并且无法实现复苏。因此，这种复苏混合物必须通过动脉管线给药，以达到心脏功能的恢复，而无需胸外按压。
当前模型中使用的肾上腺素剂量与标准CA实验中使用的剂量相似。每毫升复苏混合物原液含有400μg肾上腺素。用26μL复苏混合物储备液制备注射器，并在注射器中抽取动脉血至200μL。由于 1 mL 塑料注射器前端有 60 μL 死腔，复苏后注射器中剩余的血液为 60 μL，其中包括 6 μL 复苏混合物原液。因此，最终注射的复苏混合物原液在每只小鼠中为20μL，代表该程序中8μg肾上腺素的剂量。在该方案中，复苏溶液的量不根据体重进行调整，类似于临床环境。我们在体重为 20-32 克的小鼠中没有遇到任何复苏问题。
值得注意的是，这种复苏方案仅在这种窒息 CA 模型中成功使用。在我们的初步研究中，该方案未能在KCl诱导的CA后复苏小鼠。因此，这里描述的模型对于研究窒息CA的脑生理学特别有用。
总之，由于该模型在复苏过程中不需要胸外按压，因此 1） 鼠标可以保持俯卧位，以及 2） 头部可以安装在立体定位头架中，从而允许成像和电生理测量在整个记录阶段没有任何移动。这完全符合 CA 和复苏期间成像/监测大脑生理学的要求。该模型已成功用于旨在动态跟踪 CA 小鼠脑血流、血管反应和脑组织氧的实验，这些实验产生了关于 CA 中血管变化和药物给药反应的宝贵数据。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢凯西·盖奇（Kathy Gage）的编辑支持。这项研究得到了麻醉学系（杜克大学医学中心）、美国心脏协会资助 （18CSA34080277） 和美国国立卫生研究院 （NIH） 资助（NS099590、HL157354、NS117973 和 NS127163）的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adrenalin | Par Pharmaceutical | NDC 42023-159-01 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Animal Bio Amp | ADInstruments | FE232 | |
| BP transducer | ADInstruments | MLT0699 | |
| Bridge Amp | ADInstruments | FE117 | |
| Heparin sodium injection, USP | Fresenius Kabi | NDC 63323-540-05 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| Laser Doppler perfusion monitor | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | |
| Laser speckle imaging system | RWD | RFLSI III | |
| Lubricant eye ointment | Bausch + Lomb | 339081 | |
| Micro clip | Roboz | RS-5431 | |
| Mouse rectal probe | Physitemp | RET-3 | |
| Needle electrode | ADInstruments | MLA1213 | 29 Ga, 1.5 mm socket |
| Nitrogen | Airgas | UN1066 | |
| Optic plastic fibre | Moor Instruments | POF500 | |
| Otoscope | Welchallyn | 728 | 2.5 mm Speculum |
| Oxygen | Airgas | UN1072 | |
| PE-10 tubing | BD | 427401 | Polyethylene tubing |
| Povidone-iodine | CVS | 955338 | |
| PowerLab 8/35 | ADInstruments | ||
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | 6100701 | Injectable 50 mg/ml |
| Small animal ventilator | Kent Scientific | RoVent Jr. | |
| Temperature controller | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Triple antibioric & pain relief | CVS | NDC 59770-823-56 | |
| Vaporizer | RWD | R583S | |
| 0.25% bupivacaine | Hospira | NDC 0409-1159-18 | |
| 0.9% sodium chroride | ICU Medical | NDC 0990-7983-03 | |
| 1 mL plastic syringe | BD | 309659 | |
| 4-0 silk suture | Look | SP116 | Black braided silk |
| 6-0 nylon suture | Ethilon | 1698G | |
| 8.4% sodium bicarbonate Inj., USP | Hospira | NDC 0409-6625-02 | |
| 20 G IV catheter | BD | 381534 | 20GA 1.6 IN |
| 30 G PrecisionGlide needle | BD | 305106 | 30 G X 1/2 |
References
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