Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Моделирование рассеянного склероза у лиц обоих полов: экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, индуцированный MOG35-55

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65778
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1,4
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

ERRATUM NOTICE

Summary

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит является одной из наиболее широко используемых мышиных моделей рассеянного склероза. В текущем протоколе мышей C57BL/6J обоих полов иммунизируют пептидом гликопротеина олигодендроцита миелина, что приводит в основном к восходящему парезу хвоста и конечностей. Здесь мы обсудим протокол индукции и оценки ЭАЭ.

Abstract

Рассеянный склероз (РС) – это хроническое аутоиммунное воспалительное заболевание, поражающее центральную нервную систему (ЦНС). Он характеризуется разной распространенностью среди полов, поражая больше женщин, чем мужчин, и различными исходами, проявляя более агрессивные формы у мужчин, чем у женщин. Кроме того, рассеянный склероз весьма неоднороден по клиническим аспектам, рентгенологическим и патологическим признакам. Таким образом, необходимо воспользоваться экспериментальными животными моделями, позволяющими исследовать как можно больше аспектов патологии. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) представляет собой одну из наиболее часто используемых моделей рассеянного склероза у мышей, моделирующую различные особенности заболевания, от активации иммунной системы до повреждения ЦНС. В данной работе описан протокол индукции ЭАЭ как у самцов, так и у самок мышей линии C57BL/6J с использованием иммунизации гликопротеинового пептида 35-55 миелина олигодендроцитов (MOG35-55), что приводит к развитию хронической формы заболевания. Мы также сообщаем об оценке ежедневной клинической оценки и двигательной активности этих мышей в течение 28 дней после иммунизации (28 точек на дюйм). Наконец, мы проиллюстрируем некоторые основные гистологические анализы на уровне ЦНС, уделяя особое внимание спинному мозгу как первичному месту повреждения, вызванного заболеванием.

Introduction

Рассеянный склероз (РС) – это хроническое аутоиммунное воспалительное заболевание, поражающее центральную нервную систему (ЦНС). Он показывает наличие периваскулярной инфильтрации воспалительных клеток, демиелинизации, потери аксонов и глиоза1. Его этиология остается неизвестной, а его клинические аспекты, рентгенологические и патологоанатомические особенности указывают на замечательную гетерогенность заболевания2.

Из-за его неизвестной этиологии и сложности в настоящее время ни одна животная модель не повторяет все клинические и рентгенологические признаки, отображаемые в MS 3,4 человека. Тем не менее, для изучения различных аспектов MS 3,4 используются различные животные модели. В этих моделях инициация заболевания, как правило, является чрезвычайно искусственной, а временные рамки появления клинических признаков у людей и мышей различны. Например, у человека патофизиологические процессы, лежащие в основе заболевания, остаются незамеченными в течение многих лет до появления клинических проявлений. И наоборот, экспериментаторы могут обнаружить симптомы у животных моделей в течение нескольких недель или даже дней после индукции рассеянного склероза4.

Три основные животные модели дают признаки демиелинизации, характерные для рассеянного склероза: те, которые индуцируются вирусом (например, вирус мышиного энцефаломиелита Тейлера), те, которые индуцируются токсическими агентами (например, купризоном, лизолецитином) и различные варианты экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ)5. Каждая модель помогает изучить некоторые специфические аспекты заболевания, но ни одна из них не воспроизводит все особенности рассеянного склероза6. Таким образом, крайне важно выбрать правильную модель с учетом конкретных экспериментальных потребностей и научных вопросов, которые необходимо решить.

Благодаря процедурам иммунизации против антигенов, полученных из миелина, ЭАЭ индуцируется путем запуска аутоиммунного ответа на компоненты ЦНС у восприимчивых мышей. Взаимодействие широкого спектра иммунопатологических и невропатологических механизмов обусловливает развитие основных патологических признаков рассеянного склероза (т.е. воспаления, демиелинизации, потери аксонов и глиоза) у иммунизированных мышей 7,8. У мышей начинают проявляться клинические симптомы примерно на второй неделе после иммунизации и, как правило, наблюдается восходящий паралич от хвоста к конечностям и передним конечностям. Клиническая оценка (т.е. количественная оценка накопления дефицита, связанного с заболеванием) обычно оценивается по 5-балльной шкале7.

Активная иммунизация белком или пептидом или пассивный перенос энцефалитогенных Т-клеток может быть использована для индуцирования ЭАЭ у мышей с различным генетическим фоном (например, SJL/J, C57BL/6 и мышей без ожирения и диабета (NOD). Миелиновый протеолипидный белок (PLP), основной белок миелина (MBP) и гликопротеин олигодендроцитов миелина (MOG) являются примерами собственных белков ЦНС, из которых обычно образуются иммуногены. В частности, у мышей линии SJL/J, иммунизированных иммунодоминантным эпитопом PLP (PLP139−151), развивается рецидивирующе-ремиттирующее (RR) течение болезни, в то время как у мышей линии C57BL/6J, иммунизированных иммунодоминантным пептидом MOG35-55 , отмечается хронический характерЭАЭ 1. Несмотря на некоторые ограничения, такие как предоставление очень малой информации о прогрессировании рассеянного склероза, роли В-клеток в заболевании, механизмах выемки наизнанку или трудностях в изучении ремиелинизации, модели ЭАЭ внесли огромный вклад в понимание аутоиммунных и нейровоспалительных процессов, расширив знания в области рассеянного склероза и, таким образом, позволив разработать новые терапевтические подходы кэтому заболеванию. 6.

В настоящей работе мы сосредоточились на особой форме активного ЭАЭ, миелиновом олигодендроцитарном гликопротеиновом пептиде 35-55 (MOG35-55)-индуцированной форме 9,10,11,12. MOG35-55-индуцированная ЭАЭ моделирует хроническую форму рассеянного склероза. После иммунизации мыши проходят бессимптомную фазу в течение первой недели после иммунизации, затем болезнь обычно возникает в течение второй недели после иммунизации, в то время как между третьей и четвертой неделями после иммунизации болезнь переходит в хроническую форму, без возможности полного выздоровления от накопленного дефицита 7,8,13. Интересно, что в большинстве исследований, представленных в литературе14, не наблюдается различий между мужчинами и женщинами в заболеваемости, начале, течении или прогрессировании заболевания, даже если в меньшем количестве исследований заболевание сравнивается у мужчин и женщин.

Напротив, у людей эти параметры, как известно, имеют сильный половой диморфизм2. Рассеянный склероз чаще поражает женщин, чем мужчин; Однако у мужчин, как правило, развивается более агрессивная формазаболевания2. Эти данные свидетельствуют о существенной, а также сложной роли гонадных гормонов15; Тем не менее, роль и механизм действия половых гормонов при патологии остаются неясными. Более того, данные, полученные на животных моделях, подтверждают идею о том, что как эстрогены, так и андрогены оказывают положительное влияние на различные тракты патологии в зависимости от пола16,17.

Некоторые исследования также предполагают нейропротекторное, промиелинизирующее и противовоспалительное действие прогестерона18 , и, хотя доказательств у пациентов с рассеянным склерозом мало18, нейроактивные стероиды (т.е. de novo синтезированные нервной системой стероиды, такие как прегненолон, тетрагидропрогестерон и дигидропрогестерон) также могут влиять на течение патологии19. В совокупности эти данные подтверждают идею о том, что половые гормоны, вырабатываемые как периферически, так и внутри ЦНС, играют важную и специфичную для пола роль в возникновении и прогрессировании заболевания. Поэтому в настоящей работе мы призываем к сбору раздельных данных как от самцов, так и от самок животных.

С гистопатологической точки зрения белое вещество спинного мозга служит основным местом повреждения ЦНС в этой модели, которая характеризуется мультифокальными, сливающимися областями мононуклеарной воспалительной инфильтрации и демиелинизации8. Таким образом, описывая этот протокол индукции MOG35-55-индуцированной ЭАЭ у мышей C57BL/6J, мы примем во внимание исход заболевания у обоих полов и предоставим некоторые гистопатологические сведения о спинном мозге.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Уход за животными и обращение с ними в данной работе осуществлялось в соответствии с Директивой Совета Европейского Союза от 22сентября 2010 г. (2010/63/UE); все процедуры, о которых сообщалось в настоящем исследовании, были одобрены Министерством здравоохранения Италии (407/2018-PR) и Этическим комитетом Туринского университета (проект No 360384). Мы предлагаем привести план эксперимента в соответствие с руководящими принципами ARRIVE, первоначально опубликованными Kilkenny et al. в 2010 г.20. Перед началом работы убедитесь в наличии необходимых материалов (см. Таблицу материалов). Стерилизовать всю стеклянную посуду и приборы, используемые для приготовления эмульсии MOG35-55 , в автоклаве. Краткое изложение экспериментальных процедур представлено на рисунке 1.

1. Приготовление эмульсии MOG35-55

ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления эмульсии необходимы MOG35-55, неполный адъювант Фрейда (IFA), штамм Mycobacterium Tuberculosis H37Ra (MT) и физиологический раствор (см. таблицу материалов).

ВНИМАНИЕ: Термически убитый МТ может стимулировать врожденный иммунный ответ. Избегайте вдыхания, проглатывания и контакта с кожей и глазами, используя надлежащие средства индивидуальной защиты и взвешивая MT на закрытых прецизионных весах под капотом.

Решение Состав Примечания
2 мг/мл раствор пептида MOG35-55 Лиофилизированный пептид MOG35-55, разбавленный физиологическим раствором в концентрации 2 мг/мл Храните уже разбавленный раствор при температуре -80 °C.
Раствор PT 5 мкг/мл Лиофилизированный ПТ разводят в физиологическом растворе в концентрации 5 мкг/мл. Храните уже разбавленный раствор при температуре -80 °C.
Эмульсия Общий объем эмульсии, необходимый для каждой иммунизируемой мыши, составляет 300 мкл, разделенный следующим образом: Во избежание перебоев или загрязнения приготовьте эмульсию в день иммунизации.
200 мкг/мышь MOG35-55 , т.е. 100 мкл MOG35-55 2 мг/мл раствора.
50 мкл физиологического раствора
150 мкл ИФА
4 мг/мл МТ, т.е. 1,2 мг/мышь
Физиологическое решение Хлорид натрия 0,9% разводят в дистиллированной воде.

Таблица 1: Состав растворов, используемых для процедуры иммунизации.

  1. Приготовьте раствор в стеклянной мензурке, добавив сначала жидкий компонент и, наконец, МТ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем эмульсии, необходимый для каждой иммунизируемой мыши, составляет 300 мкл, разделенный, как указано в таблице 1. Эмульсия очень вязкая и густая, поэтому во время процедуры приготовления и инъекции могут быть некоторые потери, особенно при приготовлении раствора для нескольких мышей. Окончательный объем необходимой эмульсии мы предлагаем рассчитать, завысив количество мышей, подлежащих иммунизации, не менее чем в 1,5-2 раза.
  2. Поместите стакан в лед и с помощью стеклянного шприца с иглой 18 G начните эмульгировать раствор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмульсию можно приготовить и другими способами, например, соединив два безвоздушных стеклянных шприца с трехходовым запорным краном и перемешав раствор, толкая плунжеры вперед и назад21,22.
  3. Эмульгировать раствор не менее 15 мин; Как правило, достаточно 30 минут эмульгирования. Чтобы проверить качество эмульсии, добавьте каплю эмульсии в прозрачную емкость, наполненную водой: если капля сохранит свою структуру и останется целой, эмульсия готова.
  4. Поместите эмульсию непосредственно в шприцы объемом 1 мл, которые будут использоваться для иммунизации, и храните их при температуре +4 °C до использования, чтобы сохранить густоту эмульсии и избежать изменений или загрязнений.

2. Селекция и иммунизация животных

  1. Селекция животных
    1. Отбор взрослых мышей C57BL/6J обоего пола в возрасте 8-10 недель с оптимальной массой тела ~20 г. Обязательно выбирайте мышей соответствующего возраста и пола для разных экспериментальных групп, потому что восприимчивость к болезням может варьироваться в зависимости от возраста и пола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши должны иметь сопоставимую массу тела в день иммунизации, поскольку данная процедура оптимизирована для определенного диапазона массы тела (17-25 г).
    2. Содержать однополых животных группами (n = 4-5 на клетку), чтобы избежать социальной изоляции в стандартных условиях, в полипропиленовых клетках для мышей размером 45 см x 25 см x 15 см при температуре 22 ± 2 °C, при цикле свет/темнота 12:12 (свет включается в 08:00 утра). Обеспечьте еду и воду вволю.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В конечном итоге, чтобы еще больше ограничить потенциальную вариабельность течения болезни у иммунизированных животных, мы также предлагаем сформировать достаточно многочисленные экспериментальные группы. Существуют также исследования 8,23, в которых сроки иммунизации описываются как условие, определяющее вариабельность исхода ЭАЭ. Таким образом, мы предлагаем проводить иммунизацию примерно в один и тот же час у всех животных, предпочтительно в световые часы суточного цикла свет/темнота23. Чтобы ограничить стресс, предпочтительно манипулировать животными до дня иммунизации и помечать их, чтобы их можно было легко идентифицировать для ежедневной оценки, например, обрезания ушей или метки.
  2. Процедура иммунизации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что процедура выполняется опытным исследователем, чтобы свести к минимуму стресс для животных и оптимизировать иммунизацию. Перед началом иммунизации выберите метод анестезии в соответствии с руководящими принципами институционального комитета по уходу за животными и этики. В нашей лаборатории используется кратковременная анестезия изофлураном.
    1. Обезболивайте мышь: 4% изофлуран для индукции анестезии и 1,5-2% изофлуран для поддержания анестезии. Подождите, пока анестезия не начнет действовать, и используйте щипки задней и передней ног, чтобы оценить уровень анестезии. Чтобы предотвратить сухость глаз, пока мышь находится под наркозом, используйте одобренную ветеринаром глазную мазь.
    2. Внутривенная инъекция ПТ в латеральную каудальную вену: осторожно заткните хвост мыши раствором этанола, который действует как сосудорасширяющее средство, чтобы вывести вены. Сосредоточьтесь на одной из двух боковых вен хвоста и с помощью шприца объемом 0,5 мл с иглой 30 G введите 500 нг ПТ (т.е. 100 мкл ПТ, разведенного в физиологическом растворе в концентрации 5 мкг/мл).
    3. Подкожное введение эмульсии MOG35-55 : с помощью шприца объемом 1 мл с иглой 26 G выполнить три подкожных инъекции ранее приготовленной эмульсии: две под ростральную часть боков и одну у основания хвоста. Объем эмульсии, вводимой в каждый участок, составляет 100 мкл, при этом общий объем эмульсии составляет 300 мкл, вводимый в каждую мышь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: День иммунизации записывается как день 0 после иммунизации (dpi); Через 48 ч (т.е. при 2 dpi) необходимо выполнить еще одно внутривенное введение ПТ, равное предыдущему. Возможно проведение инъекции без анестезии, с использованием ограничителя мыши. Процедура, описанная здесь, направлена на индуцирование и поддержание анестезии мышей во время процедуры иммунизации, чтобы избежать возможного дискомфорта и движений животных или рисков как для мышей, так и для исследователей. Таким образом, хирургических вмешательств не проводится. Однако для оптимизации экспериментальных процессов важно поддерживать надлежащие стерильные условия во время этих этапов и следить за состоянием мыши после этих процедур.
    4. Чтобы убедиться, что мышь выздоровела после инъекций, поместите ее в чистую клетку после процедур и подождите, пока она не придет в сознание настолько, чтобы сохранить лежачее положение грудины. После того, как мышь полностью выздоровеет, верните ее в домашнюю клетку вместе с другими животными.

3. Последующее наблюдение за ЭАЭ

  1. Масса тела и потребление пищи
    1. Ежедневно контролируйте массу тела (МТ) животных с помощью электронных прецизионных весов, потому что снижение массы тела является индикатором прогрессирования заболевания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это снижение не должно превышать определенного процента, в соответствии с руководящими принципами институционального и этического комитета по уходу за животными. Обычно, если животное теряет более 20% от первоначальной массы тела (т.е. веса, зарегистрированного при 0 dpi), оно должно быть принесено в жертву в качестве применения гуманной конечной точки. Методы эвтаназии предполагают глубокую необратимую анестезию для ингаляции (например, 5% изофлурана) с последующим обезглавливанием.
    2. Следите за потреблением пищи (FI) - пищей, съеденной животным за день (г∙день-1∙животное-1), взвешивая количество пищи в конкретном контейнере не реже одного раза в неделю и деля количество съеденного корма за дни, прошедшие между двумя последовательными измерениями, и количество животных, присутствующих в клетке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это измерение позволяет оценить среднее потребление пищи. Из-за появления и накопления клинических признаков заболевания, которые включают паралич конечностей, мы рекомендуем класть немного поилки корма на пол клетки, когда животные не могут твердо стоять на задних конечностях и дотянуться до контейнера с кормом или бутылки с водой. Чтобы как можно точнее оценить потребление пищи в течение периода наблюдения, мы также измерили сухой вес этого корма перед тем, как смачивать его мышам.
  2. Оценка эстральной цикличности при ЭАЭ
    1. Проверяйте эстральный цикл в течение, по крайней мере, двух циклов, оценивая мазки из влагалища, как описано McLean et al.24. Классифицируйте фазы эстрального цикла на основе наличия трех первичных типов клеток — ядрообразных эпителиальных клеток, ороговевших плоских эпителиальных клеток и лейкоцитов — в образцах мазка из влагалища, следующим образом:
      1. Классифицируют как проэструсы на основании почти исключительного наличия скоплений округлых, хорошо сформированных ядрообразных эпителиальных клеток.
      2. Классифицируют как течку на основании преобладающего присутствия плотно упакованных скоплений ороговевших плоских эпителиальных клеток.
      3. Классифицируют как метеструс на основании преобладающего присутствия мелких темно окрашенных лейкоцитов и незначительного присутствия ороговевших плоских эпителиальных клеток.
      4. Классифицируют как диэструс на основании преобладающего присутствия мелких темных лейкоцитов и редких ороговевших плоских эпителиальных клеток, а также возможного появления ядросодержащих эпителиальных клеток.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При оценке заболевания у обоих полов важно проверить вариабельность у самок, обусловленную эстральным циклом. Мы предлагаем сосредоточиться на оценке эстрального цикла, особенно между первой и второй неделями после иммунизации (т.е. во время острой фазы ЭАЭ). Ранее было показано, что процедура иммунизации вызывает наиболее выраженные изменения эстрального цикла в рамкахэтой фазы 25. Кроме того, важно учитывать, что выполнение мазка при достижении животным высокого клинического балла (особенно >3) затруднено из-за заднего пареза и отсутствия тонуса в задних конечностях.
  3. Клиническая оценка
    1. Попросите слепого исследователя ежедневно оценивать клинические показатели животных. Присвойте каждому животному оценку от 0 до 5 баллов (см. таблицу 2) для оценки течения болезни26 , как описано в Racke7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в случае со снижением массы тела, гуманная конечная точка также необходима для увеличения клинических показателей, в соответствии с руководящими принципами институционального и этического комитета по уходу за животными. Как правило, если животное больше не способно питаться самостоятельно (обычно это происходит, когда животное достигает по крайней мере 4 баллов, в соответствии с используемой нами шкалой), оно должно быть принесено в жертву в качестве применения гуманной конечной точки.
  4. Оценка производительности двигателя с помощью теста rotarod
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка прогрессирования ЭАЭ обычно выполняется путем ежедневного присвоения клинической оценки, что делается полностью обученным слепым исследователем. Тем не менее, было бы полезно дополнить его более количественной и объективной оценкой прогрессирования заболевания. В предыдущем исследовании26 тест ротарода использовался для измерения двигательных показателей иммунизированных животных. Как описано van den Berg et al.27, для более количественной и точной клинической оценки течения заболевания оценка двигательных функций с помощью теста ротарода может поддержать оценку клинической оценки. Подробное описание см. van den Berg et al.27.
    1. Пусть мыши проходят сеансы ротарода ежедневно, начиная с 1 dpi до жертвоприношения (т.е. 28 dpi). Каждый сеанс состоит из одного сеанса продолжительностью 300 с, в течение которого скорость стержня должна линейно увеличиваться от 4 до 40 об/мин.
    2. Зарегистрируйте баллы животного. Когда мышь не в состоянии удерживать равновесие и падает с устройства, она падает на землю и срабатывает датчик, а время (с) записывается. Таким образом, производительность оценивается как задержка до падения (s).

Степень Клинический признак Описание
0 Здоровый Клинических признаков не наблюдается. Животное демонстрирует нормальный тонус и движение хвоста. Он ходит, не спотыкаясь.
0.5 Повреждение ворот Животное спотыкается во время прогулки по мангалу.
1 Хромой хвост Когда животное подхватывают за основание хвоста, хвост обвисает (дряблый хвост).
1.5 Хромающий хвост и поврежденные ворота Животное показывает дряблый хвост, и оно спотыкается во время прогулки по грилю.
2 Атаксия Животное с трудом встает после того, как его перевернули на спину.
2.5 Атаксия и парез задних конечностей Животное не может встать, если его перевернуть на спину, и оно теряет тонус одной из своих задних конечностей.
3 Паралич задних конечностей Животное теряет тонус обеих задних конечностей.
3.5 Паралич задних конечностей и/или парез передних конечностей Животное теряет тонус как задних конечностей, так и частично передних. На самом деле, это показывает потерю силы в хватке передних конечностей.
4 Тетрапарез Животное полностью теряет тонус конечностей.
4.5 Тетрапарез и снижение температуры тела Животное полностью теряет тонус конечностей, и у него наблюдается снижение температуры тела (ему холодно).
5 Умирающий или мертвый Животное умирает (не реагирует ни на один раздражитель) или мертво.

Таблица 2: Клиническая балльная система, используемая для оценки прогрессирования ЭАЭ.

4. Оценка ЭАЭ-индуцированных гистопатологических признаков на уровне спинного мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы кратко сообщаем о процедуре жертвоприношения животных и сбора спинного мозга для проведения гистопатологического анализа; Подробное описание см. в ссылках 10,26,28,29.

  1. Фиксация и забор тканей
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание см. в ссылках10,26.
    1. Приносите в жертву животных при 28 dpi во время хронической фазы заболевания.
      1. Обезболивайте мышей глубокой необратимой анестезией (внутрибрюшинная инъекция Золазепама и Тилетамина 80 мг/кг / Ксилазина 10 мг/кг).
      2. Транскардиально перфузируют мышей физиологическим раствором, а затем 4% раствором параформальдегида (PFA).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте внимательны при использовании PFA: поскольку он токсичен, избегайте вдыхания, проглатывания и контакта с кожей и глазами, используя надлежащие средства индивидуальной защиты. Взвесьте порошок, приготовьте раствор и выполните перфузию под колпаком.
    2. Извлеките спинной мозг из позвоночного столба30.
    3. Храните спинной мозг в 4% растворе PFA в течение 24 ч.
    4. Выполните несколько промывок в 0,01 М солевом фосфатном буфере (PBS).
    5. Встраивают спинной мозг в парафиновые блоки30.
  2. Гистологические процедуры
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание см. в Montarolo et al.10.
    1. С помощью микротома вырежьте поперечные срезы спинного мозга толщиной 10 мкм и соберите их на предметные стекла, покрытые желатином. Сориентируйте плоскость сечения в соответствии с чертежами, соответствующими поперечным сечениям мыши атласа спинного мозга31.
    2. Выполнить депарафинизацию секций32.
    3. Окрасьте срез гематоксилином и эозином32.
    4. Обезвоживайте секции32.
    5. Накройте срезы монтажной средой и дайте им высохнуть при комнатной температуре под химическим колпаком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание гематоксилин-эозином позволяет обнаружить наличие периваскулярных воспалительных инфильтратов (PvIIs)26, что оценивается как признак заболевания28.
  3. Количественный анализ срезов спинного мозга
    1. Получение изображений окрашенных срезов с помощью оптического микроскопа, подключенного к цифровой камере с 20-кратным объективом29.
    2. Проанализируйте полученное изображение, чтобы получить количество PvII, выраженное как количество инфильтратов намм2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа полученных изображений полезно воспользоваться программным обеспечением для анализа изображений. Невропатологические находки, представленные в этой работе, количественно оцениваются в 10 полных поперечных срезах спинного мозга на мышь (n = 8/группа), что соответствует уровням всего спинного мозга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Наблюдение за ЭАЭ после иммунизации
Это было оценено так, как описано ниже.

Масса тела и потребление пищи
Двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) (пол и время как независимые переменные) показывают снижение МТ ЭАЭ животных обоих полов, особенно в течение второй недели после индукции (F(1,57) = 4,952, p < 0,001; Рисунок 2А). Однако половой диморфизм при МТ сохраняется всегда (рис. 2А). В процентном соотношении BW (F(1,57) = 23,935, p < 0,001; Как самцы, так и самки демонстрируют огромную потерю от 12 до 17 точек на дюйм (p < 0,001) по сравнению с исходной МТ, но никогда не превышают 20% (рис. 2B). Таким образом, несмотря на то, что потеря МТ начинается до начала заболевания, она достигает своего максимума во время острой фазы ЭАЭ (рис. 2А,Б). Различий между полами в плане потери БО нет. Тем не менее, женщины, как правило, теряют больше веса раньше и меньше восстанавливаются во время хронической фазы (третья-четвертая неделя после индукции) (рис. 2B).

Более того, двусторонний ANOVA (пол и время как независимые переменные) также показывает достоверное снижение FI (F(9, 39) = 6,682, p < 0,001; Рисунок 2В) у обоих полов, особенно в течение второй недели после иммунизации, в результате повышенной тяжести ЭАЭ, что затрудняло животному доступ к пище, помещенной в верхний контейнер клетки. Как мы и предполагали, корм был впоследствии положен на пол клетки, чтобы уменьшить дальнейший стресс для животных. Это позволило FI вернуться к исходным уровням (рис. 2C), а BW частично восстановиться (рис. 2A,B).

Оценка эстрального цикла у самок
Сравнение времени, проведенного в разных фазах течки, проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Анализ показывает различия во времени, проведенном в эстральной фазе (т.е. проэструсе и течке) по сравнению с временем, проведенным в неэстральной фазе (т.е. метэструс и диэструс) между бессимптомной фазой (до начала ЭАЭ) и симптоматической фазой (после начала ЭАЭ) (p = 0,042; Рис. 2D), главным образом за счет увеличения времени, проведенного в диэструсе во время симптоматических фаз (р = 0,017) и тенденции к сокращению времени, проведенного в проэструсе (р = 0,08).

Уже было описано, что процедура индукции приводит к изменению эстрального цикла у самок, особенно затрагивая25-й протестр. Известно, что во время этой фазы повышающиеся уровни эстрогенов оказывают противовоспалительное и нейропротекторноедействие16 и, таким образом, возможно, ответственны за защитную роль этих гормонов во время досимптоматической фазы. Однако, когда уровень эстрогенов падает, как мы видим в пост-дебютной фазе, их защитные эффекты также заканчиваются.

Клиническая оценка и ротародная производительность
Двусторонний ANOVA (пол и время как независимые переменные) показывает значительное увеличение времени в клинической оценке (КС) как у мужчин, так и у женщин (F(56-813) = 27,951, p < 0,001; Рисунок 3А). В частности, начиная с 10 dpi, у обоих полов отмечается достоверное увеличение CS (p < 0,001), которое сохраняется до конечной точки (28 dpi) (рис. 3A). У самок КС, пусть и не значительно (р = 0,156), КС выше, чем у самцов (рис. 3А). С точки зрения начала заболевания, оно обычно происходит около 10 dpi, с тенденцией к более раннему началу у женщин, чем у мужчин (рисунок 3B). Кроме того, женщины демонстрируют значительно более высокий кумулятивный КС по сравнению с мужчинами (p = 0,017; Рисунок 3В).

Курс ротародской производительности напоминает клиническую оценку (рис. 2D). Начиная с начала заболевания, она снижается, достигая минимальных показателей в течение второй недели после иммунизации, в острой фазе ЭАЭ. Двусторонний ANOVA (пол и время как независимые переменные) показывает значительное снижение времени в ротародной производительности как у самцов, так и у самок (F(46-673) = 5,365, p < 0,001; Рисунок 3D). В частности, самцы демонстрируют минимальную производительность при 16 dpi (p = 0,022), в то время как самки - при 17 dpi (p < 0,001). Самцы, как правило, показывают лучшие результаты, чем женщины, особенно в хронической фазе заболевания (21-28 dpi), возможно, как следствие более низкого CS (рис. 3A, D).

Гистопатологическое исследование спинного мозга
Односторонняя ANOVA (пол как независимая переменная) PvII в отделах спинного мозга подчеркивает четкую разницу между мужчинами и женщинами (рис. 4A). У самок количество PvII значительно выше, чем у самцов (F(1,14)= 63,107, p < 0,001; Рисунок 4Б). Эти данные, возможно, отражают более высокую кумулятивную КС, худшую ротародную производительность и более агрессивное заболевание, наблюдаемое у самок, особенно во время хронической фазы ЭАЭ.

Эти данные также отражают тот факт, что самки мышей демонстрируют более высокую восприимчивость к развитию более агрессивной ЭАЭ по сравнению с самцами14, что является одним из основных отличий этой модели заболевания от рассеянного склероза, встречающегося у людей. У женщин заболевание начинается раньше, распространенность первичных прогрессирующих форм умеренно ниже, и в целом наблюдается меньшее прогрессирование инвалидности, чем у мужчин 2,33,34.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое временное представление экспериментальных процедур. Создано с помощью BioRender.com. Сокращения: в/в = внутривенно; s.c. = подкожный; MOG35-55 = пептид гликопротеина олигодендроцитов миелина 35-55; = dpi = день после иммунизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Оценка влияния ЭАЭ на массу тела, потребление пищи у самцов и самок мышей и эстральный цикл у самок мышей. Со дня иммунизации (0 dpi) до дня жертвоприношения (28 dpi) графики показывают (A) суточную массу тела, (B) процент массы тела и (C) еженедельную оценку потребления пищи у животных обоих полов (n = 15 на группу). (D) Время, проведенное (выраженное в среднем процентах времени) в различных фазах эстрального цикла, оцениваемое с помощью мазков из цитологического анализа влагалища, во время бессимптомной фазы (до начала заболевания, левый столбец графика) или симптоматической фазы (после начала заболевания, правый столбец графика) у самок мышей. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Статистический анализ выявил значимый эффект для p≤ 0,05 (# = мужчины против женщин; * = сравнение между разными временными точками). Сокращения: ЭАЭ = экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит; BW = масса тела; FI = прием пищи; DPI = день после иммунизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Оценка клинической оценки и ротародных показателей у самцов и самок мышей, пораженных ЭАЭ. (A) Оценка суточной клинической оценки (от 0 до 28 dpi) у животных обоего пола (n = 15/группа). (B) День начала заболевания (средний dpi) у самцов (левая колонка) и самок (правая колонка) мышей, пораженных ЭАЭ. (C) Средний кумулятивный клинический балл, достигнутый самцами мышей с ЭАЭ (левая колонка) и самками (правая колонка). (D) Оценка суточной производительности ротарод (измеряемой как латентность падения) от 6 до 28 dpi (0 представляет собой исходные значения, полученные в течение первых 5 дней теста) у животных обоих полов. Данные представлены в виде среднего ± SEM. Статистический анализ выявил значимый эффект для p≤ 0,05 (# = мужчины против женщин; * = сравнение между разными временными точками). Сокращения: ЭАЭ = экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит; CS = клиническая оценка; Cum CS = кумулятивный клинический балл; DPI = день после иммунизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Анализ воспаления в спинном мозге мышей обоего пола, пораженных ЭАЭ . (A) Репрезентативные изображения поперечных срезов спинного мозга, окрашенных гематоксилин-эозином, подчеркивают наличие PvII (стрелки) у самцов (верхнее изображение) и самок (нижнее изображение) мышей. (B) Измерение присутствия PvII в спинном мозге мышей обоего пола, пораженных ЭАЭ (n = 8/группа). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Статистический анализ выявил значимое влияние на p ≤ 0,05 (# = мужчины против женщин). Масштабная линейка = 200 мкм (10-кратное увеличение). Сокращения: ЭАЭ = экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит; * = центральный канал; PvIIs = периваскулярные воспалительные инфильтраты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный нами протокол ЭАЭ, индуцированный MOG35-55, привел к развитию хронической формы рассеянного склероза у мышей C57BL/6J 7,8,13. В этих репрезентативных результатах мы сообщили, что у животных обоего пола, прошедших процедуру иммунизации, развилась хроническая форма заболевания (т.е. они не полностью выздоравливают после начала заболевания, накапливают дефицит и поддерживают КС не менее 1,5 в хронической фазе).

Несмотря на то, что во многих исследованиях не сообщается об отсутствии различий между мужчинами и женщинами в этой модели14, только в нескольких исследованиях рассматриваются оба пола. Однако, учитывая существенные половые диморфизмы, обнаруженные в MS2, изучение исхода заболевания у обоих полов должно иметь первостепенное значение. Благодаря более поздним исследованиям, в которых участвовали представители обоих полов, наличие некоторого полового диморфизма также было описано в MOG35-55-индуцированном EAE35. В основном мы заметили, что у самок MOG35-55-индуцированная ЭАЭ, как правило, более агрессивна (учитывая более высокую восприимчивость самок мышей с этой моделью)36, поскольку они, как правило, имеют более раннее начало и более высокие кумулятивные клинические баллы, что отражает повышенное воспаление на уровне спинного мозга, чем у самцов. Один из основных выводов заключается в том, что этот протокол может индуцировать ЭАЭ как у самцов, так и у самок мышей, но исследователи должны помнить, что некоторые аспекты заболевания могут отличаться у обоих полов. Таким образом, очень важно правильно рассмотреть основной экспериментальный вопрос, выбрать наиболее благоприятную модель животного и оценить необходимость включения одного или обоих полов.

Критические шаги и возможные способы устранения неполадок
Поскольку различные модели рассеянного склероза порождают некоторые специфические аспекты заболевания, но не всешесть, первым фундаментальным шагом является выбор правильной модели с учетом конкретных экспериментальных потребностей и научных вопросов, которые необходимо решить. Во-вторых, процедура иммунизации должна выполняться специалистом, чтобы убедиться, что она проведена правильно и избежать ошибок или вариативности из-за неточных процедур. Кроме того, исследователь должен быть осведомлен о правилах защиты животных, принятых принимающим учреждением.

В-третьих, эмульсия должна быть стандартизирована в эксперименте. Следует отметить, что каждая мышь проявляет типичную восприимчивость к индукции, и, таким образом, у некоторых животных может развиться менее агрессивное заболевание или не развиться вовсе. В этом случае частота и тяжесть заболевания могут быть оптимизированы путем корректировки количества MOG35-55, вводимого мышам. В-четвертых, несмотря на то, что инъекция ПТ широко используется для облегчения индукции ЭАЭ у мышей35,36, она не является необходимой для каждого протокола37,38. При отсутствии ПТ у мышей обычно развивается менее тяжелая и более вариабельная форма EAE39. Кроме того, дальнейшая вариабельность может быть вызвана различными способами введения ПТ (например, внутривенным и внутрибрюшинным), а также тем, что эффективность ПТ варьируется в разных партиях. Чтобы решить эту проблему, важно регулировать объем в соответствии с эффективностью каждой используемой партии и правильно готовить раствор PT40,41. Принимая во внимание цели эксперимента, технические навыки исследователей и оптимизацию исследований на животных, принципиально важно выбрать наиболее подходящий протокол индукции.

В-пятых, для более объективного сбора данных настоятельно рекомендуется слепая оценка симптомов заболевания. Кроме того, мы предлагаем клиническую оценку с более количественной и объективной оценкой течения заболевания, например, оценку эффективности ротарода. Наконец, правильный отбор достаточного количества экспериментальных групп имеет основополагающее значение для получения надежных и сопоставимых данных (см. раздел 2 протокола). Для получения необходимых размеров групп в зависимости от ожидаемой величины эффекта необходимо выполнить расчет размера выборки.

Основные ограничения
Во-первых, этот протокол индукции может привести к очень вариабельным исходам у иммунизированных животных, особенно если размер группы недостаточно велик или если процедура не проводится должным образом. Во-вторых, ЭАЭ, индуцированная MOG35-55, как и любая другая доступная модель рассеянного склероза, имеет некоторые ограничения (т.е. дает очень мало информации о прогрессировании рассеянного склероза, роли В-клеток в заболевании, механизмах вывернутости наизнанку или трудностях в изучении ремиелинизации)4,6. Поэтому, опять же, очень важно правильно выбрать модель МС, необходимую для решения конкретного научного вопроса. Наконец, первичным очагом поражения является спинной мозг, и патология приводит к появлению гистопатологических признаков в каудально-краниальном плане (т.е. начиная от спинного мозга и поднимаясь вверх к головному). Это противоположно тому, что происходит у людей, и может представлять собой существенное ограничение модели. Тем не менее, можно оценить и некоторые изменения в мозге, учитывая конкретные цели.

Преимущества
Во-первых, эта модель может внести существенный вклад в понимание периферических иммуноопосредованных механизмов и оценить нейровоспалительные и, частично, демиелинизирующие процессы в ЦНС. В дальнейшем эта модель может быть применена к некоторым конкретным трансгенным линиям мышей для изучения исходов рассеянного склероза, связанных с конкретными генетическими изменениями.

Еще одним преимуществом является клиническая оценка, основанная на двух методах: оценке клинической оценки и тесте Ротарода. Это приводит к более количественной, менее субъективной и более точной клинической оценке течения заболевания. Кроме того, как указали ван ден Берг и др., оценка на основе ротастердов сильно коррелирует с площадью поверхности воспалительных поражений в двигательных системах спинного мозга27.

Как мы обсуждали ранее, несмотря на то, что эта модель не полностью воспроизводит половой диморфизм рассеянного склероза, мы считаем это преимуществом. Сочетание индукции с другими возможными факторами риска, особенно с факторами окружающей среды, может помочь в понимании специфических эффектов таких факторов и определении их специфической роли в возникновении некоторых аспектов полового диморфизма рассеянного склероза. Наконец, эта модель широко использовалась для разработки и тестирования широкого спектра терапевтических препаратов и, следовательно, имеет потенциал для разработки новых терапевтических подходов кэтому заболеванию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ни один из авторов не имеет конфликта интересов, который можно было бы заявить в отношении исследования, авторства и/или публикации данной статьи.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - проектом MIUR Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 и 2023-2027 для Департамента неврологии Риты Леви Монтальчини; Фонд Кавальери-Оттоленги, Орбассано, Италия. BB был стипендиатом INFRA-P, регион Пьемонт (n.378-35) (2022-2023) и PRIN 2020 - 20203AMKTW. Мы благодарим Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) за поддержку. Плата за публикацию была поддержана любезным пожертвованием Distretto Rotaract 2031 и, в частности, Rotaract Club Torino Nord-Est. Мы благодарим Элейн Миллер за корректуру нашей рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe  Terumo TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance Merck Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y Sigma-Aldrich HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml Sacco System  L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) VWR 213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s) Sigma-Aldrich MHS32 Filter before using it. 
Image analysis Software Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) Sigma-Aldrich F5506 Store at +4 °C. 
Isoflurane Wellona Pharma This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice Jackson Laboratory, Envigo Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. 
Microtome Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium  Merck 107961
Mouse Rotarod Ugo Basile  #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra  Difco Laboratories Inc.  231141 Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) Espikem EPK1 Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. 
Optical microscope NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127 Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. 
Pertussis toxin (PT) Duotech  PT.181 Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution 
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) B. Eurospital A 032182038 Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS) Thermo Scientific J61196.AP
Software for image acquisition  NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle  Nipro SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle PIC 20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine Rompun This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. 
Zolazepam and Tiletamine Zoletil  100 This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
  2. Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
  3. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185 (2021).
  4. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  5. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), Zurich, Switzerland. 123-137 (2017).
  7. Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , Chapter 9, Unit 9.7 (2001).
  8. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  9. Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
  10. Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
  11. Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
  12. Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
  13. Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
  14. McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It's complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
  15. Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
  16. Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
  17. Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
  18. Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
  19. Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
  20. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
  21. Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
  22. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  23. Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
  24. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
  25. Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
  26. Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
  27. vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  28. Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
  29. Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida--a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
  30. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  31. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Chapter 16 - Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. , Academic Press. 308-379 (2009).
  32. Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
  33. Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
  34. Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
  35. Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
  36. Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
  37. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
  38. Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
  39. Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
  40. Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
  41. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).

Tags

Неврология выпуск 200 MOG35-55-индуцированный экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит хроническое аутоиммунное воспалительное заболевание центральная нервная система (ЦНС) распространенность у полов агрессивные формы клинические аспекты рентгенологические особенности патологические особенности экспериментальные модели животных экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) самцы и самки мышей C57BL / 6J миелин олигодендроцитарный гликопротеиновый пептид 35-55 (MOG35-55) иммунизация хроническая форма заболевания ежедневная клиническая оценка моторика Производительность Гистологический анализ Спинной мозг

Erratum

Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

Моделирование рассеянного склероза у лиц обоих полов: экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, индуцированный MOG<sub>35-55</sub>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo,… More

Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo, F., Bertolotto, A. Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (200), e65778, doi:10.3791/65778 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter