Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול יעיל לביסוס מודל דלקת מוך בעכברים באמצעות גאג פה חדשני, ואחריו ניתוח היסטולוגי עוקב.
Abstract
דלקת מוך השן, סיבה נפוצה לאובדן שיניים טבעי, מובילה לנמק ולאובדן פעילות ביולוגית במוך השן המודלק. חשיפת המנגנונים העומדים בבסיס דלקת המוך והטיפול היעיל בה היא מוקד מתמשך של מחקר אנדודונטי. לכן, הבנת התהליך הדלקתי במוך השן חיונית לשיפור שימור מוך השן. בהשוואה לניסויים אחרים במבחנה , מודל Murine pulpitis מציע הקשר אותנטי יותר ומגוון גנטית כדי לבחון את ההתקדמות הפתולוגית של דלקת המוך. עם זאת, השימוש בעכברים, למרות עלות-תועלתם ונגישותם, מציב קשיים בשל גודלם הקטן, קואורדינציה לקויה וסבילות נמוכה, המסבכים הליכים תוך-אוראליים וטיפולי שיניים. פרוטוקול זה מציג עיצוב חדשני ויישום של פי-גאג כדי לחשוף את עיסת העכבר, מה שמקל על הליכים אינטרה-אוראליים יעילים יותר. סתימת הפה, המורכבת מקשת דנטלית זמינה לרוב רופאי השיניים ויכולה לזרז משמעותית את ההכנה לניתוח, אפילו להליכים ראשונים. מיקרו-CT, צביעת המטוקסילין-אאוסין (HE) וצביעה אימונופלואורסצנטית שימשו לזיהוי שינויים במורפולוגיה ובביטוי תאים. מטרת מאמר זה היא לסייע לחוקרים לבסס הליך ניתן לשחזור יותר ותובעני פחות ליצירת מודל דלקת במוך השן באמצעות סתימת הפה החדשנית הזו.
Introduction
מוך השן, חלק בלתי נפרד מהשן, אחראי על תפקודים חיוניים רבים כגון אספקת חומרים מזינים, היווצרות דנטין, תפקוד תחושתי ותגובות הגנה1. עם זאת, מוך השן, מוקף רקמה קשה, רגיש לפציעות ונזקים מעששת עמוקה, דלקת מוך השן, טראומה, או טיפולים הבאים 2,3. היעדר מוך שיניים פונקציונלי מגביר את הסיכון לשבריריות השן4. יתר על כן, אובדן חיוניות מוך השן בשיניים קבועות צעירות יכול להשפיע לרעה על הבשלת השן, וטכניקות התותבות הנוכחיות אינן מצליחות לשחזר את המשוב העצבי המוצע על ידי מוך4 בריא. מצב זה הוביל חוקרים לבחון פתרונות חלופיים לטיפול במוך השן המודלק מעבר להסרה.
בשנת 2007, מוריי ועמיתיו יזמו את היישום של הנדסת רקמות באנדודונטיה רגנרטיבית, ובכך עוררו עניין מוגבר בשימור מוך השן והתחדשות5. עם זאת, רקמת מוך מוך דלקתית מהווה אתגר מכיוון שתאים משחררים גורמים דלקתיים כגון IL-6, המגייסים תאים דלקתיים וגורמים לנמק תאים, אובדן חיוניות מוך השן וסיבוכים בהתאוששות תפקודית 6,7. הבנת הדלקת ומוות התאים הנלווה אליה, אם כן, חיונית להתקדמות בשימור מוך השן החיוני. ישנם מספר ניסויים שנערכו כדי לחקור את הביולוגיה המולקולרית של עיסת דלקת in vivo או in vitro 8,9. למרות שניסויים במבחנה כמו תרביות תאים דו-ממדיות או תלת-ממדיות פותחו במשך שנים והם הופכים לבוגרים ונמצאים בשימוש נרחב לבדיקת תגובות של תאי מוך השן לגורמים דלקתיים, ניסויים אלה אינם יכולים לשקף את האינטראקציה בין רקמת מוך השן לבין מערכת החיסון המערכתית10. אם התופעה הנחקרת נגזרת מתאים ממקור רקמתי אחר כמו מערכת החיסון, כלי הדם ומערכת העצבים, אזי תרבית תאי מוך טהורה תוביל למבוי סתום. לכן, ניסויים in vivo הם מאוד הכרחי התייחסות.
עכברים הפכו יותר ויותר לבחירה נפוצה במחקר דלקת in vivo בשל עלות-תועלת, פוריות גבוהה וחיוניות. עם זאת, פרוטוקול מקיף עבור מודל מוך העכברים נעדר כרגע, אשר יכול לשמש התייחסות. גודלם הקטן של העכברים ורגישותם לגירוי מציבים אתגרים משמעותיים במהלך הליכי הניסוי. התבוננות בשיניים הזעירות החבויות עמוק בתוך פי העכבר מחייבת לעתים קרובות שימוש במיקרוסקופ משופע, למרות הנוכחות הנפוצה יותר של מיקרוסקופים שולחניים במעבדות. היעדר פותחן פה דורש סיוע מאחרים. כדי להתמודד עם זה, הקבוצה פיתחה סתימת פיות באמצעות חומרים זמינים שמטרתה לספק פרוטוקול סטנדרטי וניתן לשחזור לבניית מודל פולפיטיס עכברים. מאמר זה מפרט את ההליך, ומכסה הכנה לפני הניתוח, אימוביליזציה, ניתוח חשיפה למוך השן ואיסוף דגימות על עכברי C57. פרוטוקול זה ממליץ על השימוש בסתימת הפה, ומספק מידע על מבנהו, ייצורו ויישומו כדי להקל על חוקרים אחרים לשכפל את ההליך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הליכי הניסוי במחקר זה אושרו על ידי הוועדה האתית של בית הספר לסטומטולוגיה במערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (WCHSIRB-D-2021-125). עכברי C57BL/6 בוגרים התקבלו מחברת Gempharmatech Experimental Animals, צ'נגדו, סין. כל הכתר של הטוחנת הראשונה המקסילרית מתפרץ 21 יום לאחר הלידה. עכברים לניתוח צריכים להיות מעל 21 ימים עם חיוניות רגילה11. כאן, עכברים בני 6 עד 8 שבועות שימשו לדוגמנות. איור 1 הוא דיאגרמת זרימה שמראה את הפרוטוקול שבו נעשה שימוש.
1. הכנה טרום ניתוחית (איור 2)
- השג את המכשירים הבאים: מיקרוסקופ סטריאוסקופי, צלחת קיבוע, סרט רפואי, סתימת פיות, בור שיניים זעיר פולשני בקוטר של 0.6 מ"מ, ידית שיניים במהירות גבוהה, קובץ 8# C+, כרית חימום, מזרק 1 מ"ל, כדור צמר גפן סטרילי, מלקחיים לעיניים.
- להשיג את התרופות הבאות: תערובת הרדמה, משחה וטרינרית.
2. הכנת הפה-גאג
- לשקול ולהרדים את העכבר על ידי הזרקה תוך צפקית של תמיסת תערובת הרדמה (10% קטמין הידרוכלוריד + 5% קסילזין + 85% מלח איזוטוני סטרילי) במשקל גוף של 0.007 מ"ל / גרם ולאשר הרדמה נכונה בשיטת צביטת הבוהן. החל משחה סיכה אופתלמית על העיניים כדי למנוע פגיעה בעיניים בגלל התייבשות במהלך הניתוח.
הערה: כובעים רפואיים, מסכות, כפפות וסרבלים והגנה בסיסית אחרת נחוצים. ודא שגם סביבת הניתוח וגם תא העכבר נקיים ובטוחים. כרית חום לתמיכה תרמית לאורך כל ההליך הוא הכרחי. - הכינו את סתימת הפה כמתואר להלן (איור 3).
- השג את החומרים הבאים: חוט קשת אורתודונטי בקוטר 8 מיקרומטר, צבת כיפוף לולאה צעירה, חותך תיל כבד, עט טוש, מכסה גומי באורך 3 מ"מ וקוטר חתך רוחב של 1 מ"מ.
- ראשית, יישרו את חוט הקשת ביד שמאל לצורך קיבוע ואגודל, האצבע המורה של יד ימין מתכופפת מעט כנגד קשת החוט. חזור על פעולה זו מספר פעמים, זה יקל על הכיפוף לזווית התלת מימדית הנכונה.
- השתמשו בצבת הכיפוף של לולאת יונג כדי לכופף את הקצה העליון (איור 3G, a-i) של הטרפז (איור 3C, a-l-k-b) באורך של כ-8 מ"מ בנקודת האמצע של חוט החרטום. ודאו שנקודה a (איור 3) נמצאת בקצה מקור הצבת.
- אחזו בצבת ביד שמאל, הדקו את הקצה החופשי של חוט הקשת עם אגודל ואצבע ימין, וכופפו את חוט הקשת מנקודה a ליצירת זווית של כ-120°. שכפלו את הפעולה הקודמת בנקודה i (איור 3G). בדוק אם חוט הקשת נמצא במישור אחד על ידי הנחתו על שולחן אופקי מבלי לחטט.
- השאירו אורך של כ-9 מ"מ מכל צד (איור 3D, A-B, L-K) וכופפו את הקצה החופשי לזווית של 75° באמצעות אותה מיומנות כמו שלב 2.2.4, תוך הקפדה שכל קצה נמצא במישור אחד. כופפו זווית חריפה זו עם קצה מקור הצבת.
- מצא נקודה c במרחק של כ-5 מ"מ מנקודה b. בצע את אותה מיומנות כדי לכופף זווית של 105° בנקודה c. כופפו זווית נוספת של 105° בנקודה d 5 מ"מ מנקודה c. השאירו כ-4.5 מ"מ מנקודה d ומצאו את נקודה e. כופפו את הקצה החופשי בנקודה e ליצירת זווית של כ-100-105° (איור 3E).
הערה: עכברי C57 בני 6-8 שבועות שבהם השתמשנו היו בערך 20 גרם. המרווח של 5 מ"מ יכול לא רק לתקוע את הלסת העליונה והתחתונה של העכברים מבלי לזוז, אלא גם לא ללחוץ על העור של העכברים ולגרום אי נוחות. אם משתמשים במינים אחרים או בגילים אחרים של עכברים, התאימו את אורך חלקי c-d ו-i-h בהתאם למצב האמיתי (איור 3E,G). - כופפו מדכא לשון נוסף עבור החלק המנדיבולרי (איור 3G, j-i-h-g).
- שלבי כיפוף כפולים של חלק a-b-c בחלק l-k-j. הדקו את חלקי i-k ו-k-j בו זמנית וכופפו את הקצה החופשי בנקודה j כדי להפוך אותו אנכי למישור i-k-j. מהדק נקודה i שנמצאת 5 מ"מ מנקודה j, כופף את הקצה החופשי כדי שיהיה מקביל גם למישור i-k-j וגם לחלק c-d (איור 3H).
- השאירו אורך של 5 מ"מ מנקודה i, בנקודה h, כופפו את הקשת אנכית לחלק i-h ומקבילה למישור j-i-h. מצא את נקודה g ב 5 מ"מ מנקודה h. מהדקים את מישור j-i-h-g ומכופפים את הקצה החופשי הסימטרי לחלק k-j. לאחר מכן הקצה החופשי אחרי הנקודה f צריך להיות סימטרי לקצה החופשי הנקודתי (איור 3H).
- הניחו מכסי גומי בקצה החופשי (איור 3F).
3. אימוביליזציה
- תקן את שכיבת העכבר על צלחת הקיבוע עם איברים מאובטחים על ידי סרט עור. דחסו את הקצוות החופשיים של הפה-גאג בעזרת האגודל והאצבע המורה.
- תקן את החותכות הקדמיות של העכבר בחריץ הטרפזי של שתי זרועות. ודא כי הזרוע עם מדכא הלשון הוא עבור mandibula. התאימו את הפה כדי לוודא שלשון העכבר משותקת אך לא איסכמית.
4. הערכת שיניים
- ודא כי הטוחנת הראשונה המקסילרית לניתוח צריכה להיות נקייה מעששת, טראומה ואודונטוגנזה. ודא שאין אדמומיות, נפיחות או פיסטולה על החניכיים שמסביב. ודאו שהשיניים הנגדיות בריאות וזמינות לשמש כקבוצת ביקורת בריאה.
5. חשיפה לעיסת העץ
- השתמש בבור שיניים כדי לקדוח בצד הנסתר של הטוחנת הראשונה המקסילרית במהירות של 20,000 סל"ד. ודא כי האמייל הוסר. יש לשמור את הניתוח עם ידית שיניים רק בשכבה רדודה של דנטין כדי למנוע גירוי תרמי מוגזם על רקמת מוך השן12.
- במקביל, למנוע התחממות יתר באמצעות מזרק כדי להפיל מלוחים רגילים על השן כל 3 דקות במהלך הניתוח.
- שים קובץ 8# או 10# C+ במיקום הנמוך ביותר של הבור שנקדח וחדרו דרך הדנטין האחרון כדי לחשוף את תא מוך השן. זו תהיה תחושה ברורה של נפילה כאשר דנטין מקומי מוסר ביסודיות. אין לחטט עמוק מדי, אחרת רקמת מוך השן עלולה להיות מוציאה מתא מוך השן.
- נקו את השברים סביב השן. להוריד את הפה-גאג; הניתוח הסתיים. השתמש בטוחנת הראשונה המקסילרית הנגדית כבקרה ללא פעולה.
6. טיפול לאחר הניתוח
- לאחר הניתוח, יש לתת קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג) באופן תת-עורי ולהניח את העכבר על כרית החימום הכימותרמית במצב נוטה עד להחלמה מההרדמה. האכילו את העכברים וספקו מי שתייה. יש לפקח על תהליך ההחלמה. אף בעל חיים אחר לא צריך להיות באותו חדר עד שהעכבר מתאושש לחלוטין.
7. איסוף ואחסון דוגמאות
- יש להרדים את העכבר עם נקע צוואר הרחם בתנאי הרדמה עמוקה 24 שעות לאחר הניתוח או בכל נקודת זמן אחרת לפי ניסוי9. חותכים את שרירי השלד המחוברים למקסילה ולזיגומה בעזרת מספריים אופתלמיים. הסר שלד, עצם קדמית ורקמות רכות והוציא את gnathostegite lamina עם טוחנות מקסילריות.
הערה: על פי He et al., יש לשבח כי יש לאסוף דגימת דלקת מוך פחות מ -72 שעות לאחר הניתוח כדי למנוע נמק נרחב ברקמת מוך השן13. - קשת לחלק את gnathostegite לשניים ולאחסן את הרקמה ב 4% paraformaldehyde ב PBS, pH 7.4, ב 4 ° C עבור קיבוע 24h.
8. ניתוח היסטולוגי
- שטפו את הרקמה במי מלח חוצצים פוספט (PBS) ובטלו אותם בתמיסת הסתיידות יומית של 5% EDTA ו-4% סוכרוז ב-PBS, pH 7.4, ב-4°C למשך 2-4 שבועות10.
- הטמע את 1/2 gnathostegite בפרפין וודא הפנים sagittal ללא שיניים הוא בחלק התחתון של קלטות רקמות.
- חותכים את גוש הפרפין לפרוסות בעובי 5 מיקרומטר עם מיקרוטום פרפין. התאימו את זווית גוש הפרפין בהתאם למערכת היחסים הפרוקסימלית, הדיסטלית, העליונה והתחתונה שנצפתה במיקרוסקופ כדי להבטיח שניתן יהיה לחתוך את עיסת הכתר המלאה ואת הניקוב של הטוחנת הראשונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההליך המתואר לעיל בוצע בטוחנת הראשונה המקסילרית הימנית של עכברי C57BL/6 בני 3, 6-8 שבועות, ואילו הטוחנות הראשונות המקסילריות השמאליות נשמרו כביקורת. תוצאות היסטולוגיה ואימונופלואורסנציה מבקרה ריקה, דגימות של 12 שעות פולפיטיס ו-24 שעות של פולפיטיס שימשו להדגמה.
בעקבות פרוטוקול של ניתוח CT מגולדמן ועמיתיו 15, החשיפה למוך השן אושרה באמצעות מיקרו-CT ומידול שחזור באיור 4 A-C. פרוסות קשת של הטוחנות הראשונות המקסילריות, הן מצד הבקרה והן מצד הניתוח, עברו צביעת HE (איור 5). הודגמו נמק של רקמת מוך השן והתפוררות מורפולוגיית התא בשולי הפצע. הנמק התרכז בעיקר ברקמת מוך השן הסמוכה לנקב, וצורת רקמת מוך השן בצד שלא נפתח הייתה תקינה. לאחר 24 שעות, רוב רקמות מוך השן, כולל מוך השורש, היו שלמות מבחינה מורפולוגית. (איור 5).
הביטוי של IL-614 היה נמוך בשליטה, כמות קטנה של IL-6 ניתן לראות סביב הפצע ב 12 שעות, בעוד הביטוי של IL-6 גדל באופן משמעותי ב 24 שעות. יתר על כן, הביטוי של IL-6 היה מרוכז בעיקר בשולי הפצע ובקרן מוך השן האמצעית (איור 6). באיור 6 D,E, מספר תאי מוך השן IL-6+ והיחס בין תאי IL-6+ לסך תאי מוך השן גדל עם הזמן בשלוש נקודות זמן. זה יכול להיחשב כי האזור בהדרגה מפתחת דלקת מחמיר לאחר חשיפה מוך השן.
הזמנו 5 עמיתים שמעולם לא ביצעו ניתוח בשיניים מקסילריות של עכברי C57 כדי לחשב את הזמן הדרוש להם כדי לשתק את הלסת העליונה והתחתונה של העכבר (שלב 1) ולחשוף את הטוחנת הראשונה המקסילרית של העכבר (שלב 2) לאחר ההליך המסורתי עם שתי גומיות המתייחסות לפרוטוקול שפורסם על ידי גולדמן ואחרים או לפרוטוקול שלנו עם סתימת פיות15. הזמן למיקום המקדח כראוי על הטוחנת הראשונה המקסילרית של העכבר תחת מיקרוסקופ חושב גם הוא לניתוח. התוצאות באיור 3 J,K הצביעו על כך שזמן קיבוע הפה ומציאת הטוחנת הראשונה של עכברים עם הפה-גאג התקצר משמעותית בהשוואה לדרך המסורתית (P<0.05). השימוש בפה יכול לשפר את יעילות התפעול ולהפחית את קושי הניתוח.
איור 1: דיאגרמת זרימה של הליך חשיפה למוך השן. (A) לאחר קיבוע עם פה-גאג, הטוחנת הראשונה המקסילרית של העכבר צריכה להיות חשופה במלואה מתחת למיקרוסקופ. (B) השתמש בידית שיניים במהירות גבוהה עם בור שיניים זעיר פולשני כדי להסיר אמייל חסימה ודנטין שטחי של הטוחנת הראשונה, אך היזהר לא לחדור ישירות לדנטין כדי למנוע השפעה מוגזמת על מוך השן הנגרמת על ידי התחממות יתר. (C) השתמש בקובץ 8# C+ כדי לחדור את הדנטין הנותר ולחשוף את מוך השן. (D) הדגימות נאספו 24 שעות לאחר הניתוח. HE וצביעה אימונופלואורסצנטית הוכיחו כי ניתן לבסס מודל פולפיטיס בנקודת זמן זו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ציוד להליך חשיפה למוך השן. (A) מיקרוסקופ סטריאוסקופי ומנוע של ידית שיניים במהירות גבוהה. (B) קובץ 8# C+, בור שיניים זעיר פולשני, סתימת פיות, פינצטה וידית שיניים במהירות גבוהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ביצוע סתימת הפה. (A) כופפו את החוט כדי ליצור שתי זרועות עובדות של הפה-גאג. (ב-ג) שלבים של כיפוף מרית הלשון לסת התחתונה. (ד-ה) אין מרית לשון למקסילה. (ו, ח) כובעי גומי או קצוות מכופפים נחוצים כדי להגן על הפציעה מפני דקירה. (ז) שלוש דעות של סתימת הפה לעיון. (I) שימוש קליני בסתימת פיות. (J) הזמן הממוצע למתחילים לתקן את הלסת העליונה והתחתונה (שלב 1) בשיטת הקיבוע המסורתית וסתימת פיות, בהתאמה. (K) הזמן הממוצע למתחילים למצוא בבירור את הטוחנת הראשונה המקסילרית (שלב 2) בשיטת הקיבוע המסורתית ובפה-גאג, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח מיקרו-CT של טוחנת אגרוף מנותחת עם ניקוב המסומן בקו אדום מקווקו. (A) מישור קשת של השן, יש לוודא שלא קיים נקב ברצפת מוך השן. (B) מישור קורונלי. בהתאם לנקב ב-(A), ניתן להבחין בחדירה מלאה של דנטין האמייל המוקף בקו אדום מקווקו. (C) מישור נסתר של מודל שחזור CT. מיקום הנקב המוקף בקו אדום מקווקו מאושר בצורה אינטואיטיבית יותר וניתן לצפות ברצפת תא העיסה באמצעות ניקוב. (ד-ג) תמונות תוך ניתוחיות של הטיפול. (D) בדוק את הטוחנת הראשונה המקסילרית של העכבר כדי לוודא שאין חללים או מומים. (E) שימוש בבור זעיר פולשני להסרת אמייל ודנטין רדוד. כפי שניתן לראות בתמונה, ניתן לראות בור (מוקף בקו לבן מקווקו) על פני השן החסומה ללא ניקוב. (F) באמצעות קובץ 8# C+ כדי לחדור את הדנטין הנותר, הקובץ יכול להיתקע בשן ללא תמיכה ידנית. (G) בעת הוצאת הקובץ, יש לשן נקב ורוד, המעיד על חשיפה מוצלחת למוך השן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: צביעת Hematoxylin-eosin. (A) ראייה הוליסטית של טוחנת ראשונה לא מטופלת לצורך ביקורת. (א-1,2,3) נתוני הגדלה גבוהה המתאימים ל- 1, 2, 3 בלוח (A). צורת רקמת מוך השן ב-3 עמדות הייתה שלמה, ואודונטובלסטים היו בסידור מסודר. (B) ראייה הוליסטית של השיניים 12 שעות לאחר הניתוח. (ב-1,2,3) נתוני הגדלה גבוהה המתאימים ל- 1, 2, 3 בלוח (B). צורת רקמת מוך השן במיקומים 1 ו-2 הייתה בדרך כלל שלמה. נמק ניתן לראות ליד הנקב. (C) ראייה הוליסטית של השיניים 24 שעות לאחר הניתוח. (ג-1,2,3) נתוני הגדלה גבוהה המתאימים ל- 1, 2, 3 בלוח (C). הנמק משתרע מקרן מוך בודדת לרקמת מוך השן הסמוכה. אבל רוב רקמות מוך השן, כולל מוך השורש שלמות מורפולוגית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: צביעה אימונופלואורסצנטית. (A) ראייה הוליסטית של טוחנת ראשונה לא מטופלת לצורך ביקורת. (א-1,2,3) נתוני הגדלה גבוהה המתאימים ל- 1, 2, 3 בלוח (A). כמעט ולא ניתן היה להבחין בביטוי של IL-6. (B) ראייה הוליסטית של השיניים 12 שעות לאחר הניתוח. (ב-1, 2, 3) נתוני הגדלה גבוהה המתאימים ל- 1, 2, 3 בלוח (B). הגדלת IL-6 מרוכז ברקמה ליד הנקב המוצג B-3. לא נצפו שינויים ברורים ב-B-1,2. (C) ראייה הוליסטית של השיניים 24 שעות לאחר הניתוח. (ג-1, 2, 3) נתוני הגדלה גבוהה המתאימים ל- 1, 2, 3 בלוח (C). הביטוי של IL-6 גדל באופן משמעותי ב- C-2,3. (D) הכמות הכוללת של תאי מוך השן IL-6+ בבקרה, 12 שעות חשיפה למוך השן, 24 שעות חשיפה למוך השן תוצאות צביעה אימונופלואורסצנטית. (E) יחס בין תאי IL-6+ לכמות הכוללת של תאי מוך השן בביקורת, 12 שעות חשיפה למוך השן, 24 שעות חשיפה למוך השן תוצאות צביעת מוך האימונופלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כרקמה הרכה הבודדת בתוך השיניים, מוך השן ממלא תפקיד מכריע בשמירה על הפעילות הביולוגית של השן, אך נותר רגיש מאוד. שימור מוך מוך חיוני זה הפך לגישה הראשונית המועדפת בטיפולים האנדודונטיים האחרונים, המחייבים הבנה מקיפה של המנגנונים הדלקתיים של מוך השן16. התנודות המרחביות-זמניות של המיקרו-סביבה הדלקתית והאינטראקציות בין סוגי התאים המקומיים בדלקת המוך מסבכות את חקירתה באמצעות מחקרי מבחנה 11. במקום זאת, מחקרי in vivo מציעים יתרונות על ידי שכפול הסביבה הפיזיולוגית המצויה בבני אדם. שימוש בעכברי ניסוי, במיוחד אלה עם גנים בעלי ביטוי יתר או הפלה עצמית, מספק כלי יעיל לאימות השערות. עכברי C57 הנמצאים בשימוש תכוף במעבדות, לעומת זאת, מציבים אתגרים בשל גודלם הקטן וחוסר הקואורדינציה, מה שהופך את יישום הגירויים על שיניהם לבעייתי17. כדי להתמודד עם בעיה זו, יש צורך בהסבר מקיף על סתימת פיות חדשה כדי לסייע לחוקרים לבצע הליכים בתוך חללי הפה של עכברים. יתר על כן, מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לביסוס מודל דלקת מוך באמצעות חשיפה למוך השן על הטוחנת הראשונה של העכברים באמצעות הפה-גאג, ובכך מציע מדריך רב ערך למחקר הבא.
לאחר גלגולים רבים, תוכנן בהצלחה פער-פה מדרגי ופשוט לבנייה. הממדים וסכמת שלוש התצוגות של סתימת הפה מוצגים באיור 3. הפרוטוקול פישט משמעותית את תהליך כיפוף החוטים על ידי אימוץ עיצוב טרפזי במקום קשת. הפה משתמש בחוט קשת אורתודונטי בקוטר 0.8 מ"מ, המאזן את הצורך למנוע החלקה מפיו של העכבר ולספק כוח פתיחה מספיק. יתר על כן, גמישות חוט הקשת האורתודונטית שומרת על המפרק הרקתי של העכברים. הפה קומפקטי, עמיד בפני קורוזיה, וניתן לאחסן אותו בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל עם אלכוהול לשימוש חוזר. למרות לחץ הנשיכה של העכבר, הפה נשאר יציב בפה, מה שמאפשר לחוקרים לפעול ללא סיוע תחת מיקרוסקופ. יש לציין כי ניתן להתאים את גודל הפה כך שיתאים לגדלים שונים של גוף העכבר. אם הפה מתוח מעבר לגבול העכבר, יש להסיר מיד את הפה כדי למנוע פגיעה במפרק הרקתי (TMD) או בשרירי הלסתות.
הדו"ח של הוא ואחרים מצביע על כך שניתן לזהות נמק 24 שעות לאחר חשיפה למוך השן, כאשר רוב רקמת מוך השן הופכת לנמקית לאחר 72 שעות18. לפיכך, חיוני לאסוף את רקמת מוך השן בתוך חלון זה של 72 שעות כדי למנוע מסקנות ניסוי לא תקפות עקב תאים מתים מוגזמים. בעת החדרת קובץ C+ לתא מוך השן, יש להימנע מסיבוב חוזר ודחיפה עמוקה כדי למנוע נזק מוגזם לרקמת מוך השן. אם מתרחש דימום כבד במהלך ההליך, מומלץ להסיר בעדינות את הדם באמצעות כדור צמר גפן קטן כדי למנוע שיעול. הניתוח צריך להתבצע רק בצד אחד של מקסילה העכבר בשל ההשפעה השלילית הפוטנציאלית על דיוק המודל מדוגמנות בו זמנית משני הצדדים, מה שעלול לגרום לסיבוכים בצריכת התזונה. לאחר הניתוח, מומלץ לא לתת תרופות אנטי דלקתיות או אנטיביוטיקה לעכברים.
לסתימת הפה, אף שהיא יעילה בשמירה על פה העכבר פתוח, יש מגבלות הנוגעות לאתר הניתוח. השיניים האחוריות המנדיבולאריות, המוגנות על ידי הלשון הנלחצת באמצעות מדכא לשון, לרוב אינן נראות בבירור. לכן, ההליך מתאים רק לניתוחים על שיני המקסילה או השיניים הקדמיות המנדיבולרית. אם הניתוח עולה על 20 דקות, מומלץ לתת לעכבר הפסקה כל 10 דקות, שכן יציבות הפה תלויה באנטגוניזם של כוח החסימה של העכברים. עכברי C57, שנבחרו בשל ההתרבות והזמינות המהירה שלהם, רגישים לגירויים שונים; לפיכך, מנת יתר קלה של תרופות או גירויים יכולה להיות קטלנית. יתר על כן, גודלן הקטן של שיניהם דורש רמת מיומנות גבוהה יותר לחיתוך רקמות.
לסיכום, דלקת במוך השן ונמק מהווים אתגרים דחופים בהתחדשות מוך השן. מחקר זה מציע הדגמה מקיפה של יצירת מודל דלקת מוך בעכברים, עם תוצאות immunofluorescence לאמת את הגורמים הדלקתיים. מאמר זה מציע עיצוב חדשני ונוח לסתימת פיות, המספק למפעיל ראייה ללא הפרעה על ידי שמירה על פיו של העכבר פתוח ללא הפרעה ללשון. עם זאת, ניתוחים בשיניים האחוריות המנדיבולאריות נותרו אתגר. בהתחשב ביתרונות השימוש בעכברי ניסוי, מודלים אנדודונטיים בעכברים טומנים בחובם הבטחה משמעותית, ומתוכנן לצפות להפחתה נוספת בסף הטכני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין U21A20368 (L. Y.), 82101000 (H. W.) ו- 82100982 (F. L.), ועל ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן 2023NSFSC1499 (H. W). כל הנתונים והתמונות המקוריים כלולים במאמר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| C57/B6J mice | Gempharmatech Experimental Animals Company | C57/B6J | For the establishment of pulp exposure |
| Equipment | |||
| 1 mL syringe | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB1-074(IV) | Apply in drug injection. |
| 8# C+ file | Readysteel | 0010047 | Apply in exposing the roof of pulp chamber. |
| Anesthesia Mix solution | 10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline. | ||
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus. |
| Dental high-speed dental handpiece | Jing yuan electronic commerce technology | WJ-422 | Apply in pulp exposure. |
| Heavy wire cutter | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply inarc cutting. |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | BL700B | For the histological analysis of the slides. |
| IL-6 antibody | Novus | NBP2-89149 | Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp. |
| Ketamine(Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | 100mg/kg, IP. Apply in nesthetization. |
| Medical tap | 3M | 1530 | Apply in mice immobilization. |
| Orthodontic arch wire | Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD. | K417 | Diameter of 8µm |
| Round dental burr (0.6 mm) | Shofu global | 072208 | Apply in removing enamel and shallow layer of dentin. |
| Young loop bending plier | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply in arc bending. |
References
- Kleinert, A., Kleinert, L., Ozimirska, M., Chałas, R. Endodontium - together or separately. Folia Morphol. 77 (3), 409-415 (2018).
- Dhillon, H., Kaushik, M., Sharma, R.
- Prati, C., Pirani, C., Zamparini, F., Gatto, M. R., Gandolfi, M. G. A 20-year historical prospective cohort study of root canal treatments. A Multilevel analysis. Int Endod J. 51 (9), 955-968 (2018).
- Su, Y., Wang, C., Ye, L. Healing rate and post-obturation pain of single- versus multiple-visit endodontic treatment for infected root canals: a systematic review. J Endod. 37 (2), 125-132 (2011).
- Murray, P. E., Garcia-Godoy, F., Hargreaves, K. M. Regenerative endodontics: a review of current status and a call for action. J Endod. 33 (4), 377-390 (2007).
- Arora, S., et al. Potential application of immunotherapy for modulation of pulp inflammation: opportunities for vital pulp treatment. Int Endod J. 54 (8), 1263-1274 (2021).
- Eramo, S., Natali, A., Pinna, R., Milia, E. Dental pulp regeneration via cell homing. Int Endod J. 51 (4), 405-419 (2018).
- Hasan, A., et al. Expression of Toll-like receptor 2, Dectin-1, and Osteopontin in murine model of pulpitis. Clin Oral Investig. 27 (3), 1177-1192 (2023).
- Wang, Y., et al. DDIT3 aggravates pulpitis by modulating M1 polarization through EGR1 in macrophages. Int Immunopharmacol. 120, 110328 (2023).
- Richert, R., et al. A critical analysis of research methods and experimental models to study pulpitis. Int Endod J. 55 (Suppl 1), 14-36 (2022).
- Huang, X. F., Zhao, Y. B., Zhang, F. M., Han, P. Y. Comparative study of gene expression during tooth eruption and orthodontic tooth movement in mice. Oral Dis. 15 (8), 573-579 (2009).
- Kwon, S. J., et al. Thermal irritation of teeth during dental treatment procedures. Restor Dent Endod. 38 (3), 105-112 (2013).
- He, Y., et al. Pulpal tissue inflammatory reactions after experimental pulpal exposure in mice. J Endod. 43 (1), 90-95 (2017).
- Karrar, R. N., et al. Molecular biomarkers for objective assessment of symptomatic pulpitis: A systematic review and meta-analysis. Int Endod J. 56 (10), 1160-1177 (2023).
- Goldman, E., Reich, E., Abramovitz, I., Klutstein, M.
- Duncan, H. F. Present status and future directions-Vital pulp treatment and pulp preservation strategies. Int Endod J. 55 (Suppl 3), 497-511 (2022).
- Shi, X., Li, Z., He, Y., Jiang, Q., Yang, X. Effect of different dental burs for experimental induction of pulpitis in mice. Arch Oral Biol. 83, 252-257 (2017).
- Du, W., et al. Indigenous microbiota protects development of medication-related osteonecrosis induced by periapical disease in mice. Int J Oral Sci. 14 (1), 16 (2022).
