哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA

Summary

ここでは、細胞分裂に関与する遺伝子のハイスループットスクリーニングに人間esiRNAライブラリを使用してください。我々は、セットアップとesiRNA画面だけでなく、どのように結果を分析し、検証するために実施する方法を示します。

Abstract

RNA干渉（RNAi）は遺伝子発現の制御のための基本的な細胞メカニズムです。 RNAiはまた、低分子干渉RNA（siRNA）として知られている短い二本鎖RNAによって誘導される。短い二本鎖RNAはDicerによって、エンドヌクレアーゼのRNase IIIファミリーのタンパク質の活性によって長い二本鎖の前駆体に由来する。得られた断片は、同種の標的mRNAにそれを指示、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）のコンポーネントです。 RISCは、それによってコードされるタンパク質^1,2,3の発現を減少させる標的mRNAを切断する。 RNAiは、低分子干渉RNAを利用した哺乳動物細胞における遺伝子機能の研究の損失のための強力で広く使用されている実験的な方法となっている。

現在、2つの主な方法は低分子干渉RNAの生産のための利用可能です。別の方法は in vitro でのRNase IIIによってターゲット固有の長い二本鎖RNAのエンドヌクレアーゼ的切断を採用したのに対し、一つの方法は、化学合成を含む。これにより、siRNA様オリゴヌクレオチドの多様なプールは、エンドリボヌクレアーゼに準備したsiRNAまたはesiRNAとして知られて生成されます。化学的に誘導されたsiRNAとesiRNAsの有効性の比較は、両方のトリガーは、標的遺伝子のサイレンシングに強力であることを示しています。特異性を比較するときの違いは、しかし、見ることができます。 esiRNAsに内 ​​在する複雑な混合物はより具体的なノックダウン¹⁰につながる一方、多くの単一の化学的に合成されたsiRNAは、著名なオフターゲット効果を生み出す。

本研究では、我々は、ゲノム規模のミッションesiRNAライブラリと細胞周期の進行に関与する遺伝子の同定のためのDNA -コンテンツの画面に代表されるRNAiスクリーニングのためのその活用のデザインを提示。我々は、トランスフェクションプロトコルと高スループットのスクリーニングのためのアッセイを最適化する方法を示します。我々はまた、統計的に評価できる方法大規模なデータセットを示し、主要なヒットを検証する方法を提示する。最後に、我々は検証のヒット、さらに機能的特性評価のための潜在的な出発点を与える。

Protocol

1。高品質のミッションesiRNAライブラリ興味のあるすべての遺伝子のためにRNAiの影響を最も受けやすいと特定のターゲット領域はDEQORアルゴリズム（http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html）を利用して選択されます。すべての4 DEQORスコアサイレンシングの可能性ターゲットmRNAの可能性が21ヌクレオチドの長siRNAは、最先端の設計の制約より4。さらに、それぞれの潜在的なsiRNAは、研究の生物のトランスクリプトームに対するBLAST検索を実行することによって、他の遺伝子との交差反応性可能性について分析する。プログラムは、それによって全体的な品質と潜在的なesiRNA（300〜600 bpの長さ）のクロスサイレンシング能力の分析を提供します。 cDNAをターゲット遺伝子の選択した領域は、バクテリオファージRNA -ポリメラーゼプロモーター配列に隣接する遺伝子特異的プライマーを用いたPCRによって増幅される。 ミッションesiRNAの生産に使用されるすべてのPCR産物は、キャリパーLabchip解析により配列決定によって同一性および純度のための検証されます。 長い二本鎖RNAが転写された鎖のアニーリングに続く、RNAポリメラーゼによってPCR産物から転写される。 esiRNAsは、Q -セファロースのスピンカラムを利用した陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製してRNaseIIIを使用して、長い二本鎖RNAの制限酵素消化によって調製される。 esiRNAsが析出し、TE緩衝液に再懸濁する。収率は、UV -吸収測定によって測定され、濃度は、TEバッファーの適切な量に溶解して調整されます。最終製品の全体的な品質は、キャリパーLabchip分析により確認された。 2。細胞株を選択し、スクリーニングのためにトランスフェクションを最適化 esiRNA（ポジティブおよびネガティブコントロールとして、ウミシイタケルシフェラーゼとして使用Eg5）と384ウェルプレートでトランスフェクション試薬の量を増加させるの滴の量は、48時間細胞をインキュベートを追加。 Eg5は双極紡錘​​体集合と枯渇のために必要なキネシンのモータータンパク質が有糸分裂停止につながるです。異なるトランスフェクション試薬と細胞株について、この手順を繰り返します。ここで、我々は、トランスフェクション試薬として標準的な手順とオリゴフェクトアミン（Invitrogen社）に続く培養したHeLa細胞を使用してください。 最適なトランスフェクション条件を選択するための有糸分裂停止（丸形）と光学顕微鏡によるウミシイタケルシフェラーゼ（RLUC）esiRNAをトランスフェクションした細胞の総数を表示Eg5 esiRNAsでトランスフェクトされた細胞を数える。 RLUCには、少なくとも毒性とEg5のための最も顕著な表現型との条件を選択してください。 トランスフェクション条件を最適化するための代替方法は、恒常的活性プロモーターの制御下にEG​​FPを（または他の適当なレポーター遺伝子）を発現する安定細胞株を含む。 EGFP（または別のレポーター遺伝子）とRLUC（または別の適切な陰性対照esiRNA）などの蛍光アシストセルソーティング（FACS）により測定ノックダウン効果と毒性に対するesiRNAのトランスフェクション後。 EGFPのために使用esiRNAは、ターゲットmRNAに完全に相補的であることを確認してください。 3。プライマリ画面5,6の設定自動化されたピペッティングステーション（例えばアクエリアス、テカンとWellMate、マトリックス）上のすべての使用されるコンポーネントのためのピペッティングの精度を最適化する。ピペッティングのパラメータは、ソリューション、ボリュームとプレート型のタイプに応じて変化するため、この最適化は個別にすべてのステップのために反復する必要があります。可能であれば、ピペッティングステーションは、汚染を避けるために、層流フードの下に配置する必要があります。すべての使用されるコンポーネントは、該当する場合はオートクレーブして、75％エタノールを噴霧してどちらかの使用前に消毒されるべきである。ウェルからのクロスコンタミネーションがうまく除外されるように洗って、プロトコルを最適化する。自動化されたピペッティングの最適化の詳細は、スペースの制約を与えるためのものと利用ピペッティングステーションに大きく依存することはできません。詳細については、プロトコルを製造するために参照してください。 Eg5とRLUC用esiRNAsで上から最適化された条件を用いて384ウェルフォーマットでのトランスフェクション細胞。プレート全体をカバーするEg5とRLUC esiRNAのための交互のパターンを使用してください。 48時間のインキュベーションが冷たい100％エタノールで細胞を固定した後、1μg/ mlのDAPIおよび100μg/ mlのRNase Aを（Qiagen）を含むPBSで25分間染色、15分間PBSで再水和する。最後に4℃でPBSと店舗で洗浄℃にオリンパスScanRシステム上で顕微鏡などによるDAPI蛍光の測定強度。細胞数に対してDAPI強度をプロットすることにより、ヒストグラムを生成し、G1期のためにDNA -コンテンツの2Nと細胞の割合を計算することによって、細胞周期の分布を評価する。<2N> S相の4N、G2/M-phase用4Nと異数性/倍数性のための> 4N。 プレート上の結果の均質性を評価する。結果は、位置のEFFEを除外するために大幅に異なる場合は、さらに最適化が必要ですCTS。マルチウェルプレートを使用して一般的な問題は、インキュベーション時間の間にエッジの井戸で強化された蒸発です。これは多くの場合、板の位置特異的な効果に変換する別の井戸の異なる実験条件、につながる。このような理由から、我々は、画面の空のすべてのエッジの井戸を残すことをお勧めします。さらに蒸発を最小限に抑えるためには、インキュベーターが高湿度に保たれていることを確認します。我々はまた、日常的にこのような蒸発をブロックコーニング通気性のシールテープなどの蒸発障壁を採用しています。また、位置効果のための他のリソースは考慮、例えば、技術的な読み出しシステムの変化（顕微鏡、プレートリーダー、など）や液体ハンドリング（勾配、ソリューションの不均一性、等）のばらつき考慮する必要があります。 陽性および陰性対照との間に統計学的な違いは、雇用検定の重要性の尺度を提供しています。ネガティブコントロール（またはバックグラウンドノイズ、モックコントロール）の間に大きな違いは、サンプルでは、​​実際のスクリーニングを開始する前に確立する必要があります。統計的有意性のための良好な尺度は、Z -因子である。 Z -係数は次式以下の式で計算されます。 Z = 1 – （3 SD [サンプル] + 3 SD [モック]）*（| AV [サンプル] – AV [モック] |）-1; SD付：標準偏差、AV：平均。 1のZ因子> Z> 0.5は、ポジティブコントロール7から陰性コントロールの統計的に有意な分離（およびノイズ）を示します。 4。主な画面上記の最適化条件を利用esiRNAsのトランスフェクションのために384ウェル組織培養プレートを準備します。ここでは、ウェルあたり5μlのTE緩衝液に溶解15ng esiRNAを使用してください。プレート当たり少なくとも8つの制御位置は、研究対象の生物学的プロセスに適したポジティブコントロールとネガティブコントロール（：Eg5とRLUCここ）でロードする必要があります。エッジの井戸のみ5μlのTE bufferでロードされる位置の影響を避けるために。 ウェルあたり0.2μlオリゴフェクトアミンを含む5μlのOPTIMEMを（Invitrogen）を追加し、混合し、室温で20分間インキュベートする。 トランスフェクション混合物の上に細胞懸濁液（ここで25細胞/μlの濃度でHeLa細胞の細胞懸濁液の40μlの、ウェル当たり1000個の細胞に相当）を追加し、72時間インキュベートします。 自動顕微鏡（オリンパスScanR、上記参照）でDNA含量を測定する。ヒットの選択のためのZ -スコアの統計情報を使用して評価する：Z -スコアは、基準として負の制御用信号を使用して、すべてのサンプルesiRNAsに対して計算されます。 （注）、Z -スコアは、Z -ファクターと同じではありません。 Z -スコアは、（モック）対照と比較して、サンプル値の有意性のための統計的尺度を提供しています。それは、方程式は、次の式で計算されます。 Z =（値[サンプル] -平均[モック]）*標準偏差[モック] -1。 ヒットの選択のしきい値は適用する必要があります。通常は、重要性の基準が好き：2 <Z <-2を使用するが、データセットの品質に応じて、生物学的プロセスまたは単に画面の範囲を検討され、別のしきい値が必要となる場合があります。かなり簡単なZ -スコアの統計情報の横にも、より精巧な数学的評価手法は、（スクリーニングデータの統計的評価の幅広い分野への最初の内部にはマロらで見つけることができます。8）使用することができます。 5。二次スクリーンとヒットの検証二次の画面では、実験誤差やオフターゲット効果による偽陽性を排除するために、主画面に従います。選択されたヒットの場合、主画面で使用したのと同じ手順では、より良い統計的評価を可能にするために複製の大きい番号（3-5）を繰り返す必要があります。 検証されたヒットの場合、初期画面で識別された目標に対する二次の非オーバーラップesiRNAは（または他の非オーバーラップサイレンのトリガ）を使用する必要があります。同じアッセイおよび読み出しは、一次スクリーニング用として適用する必要があります。 最終的に選択された遺伝子は、異種間のRNAiレスキュー9によって検証することができます。それによって遺伝子のマウスのオルソログなど細菌人工染色体（BAC）のエンコーディングを安定的に細胞にトランスフェクトされる。 BAC -コンストラクトは、そのゲノムの文脈で遺伝子を保持し、ほぼ生理的な発現を可能にする。内因性のヒト遺伝子に対するRNAiは、RNAi表現型を救出変更されず、マウスの導入遺伝子の発現を残す。 RNAiによる救助は、これまでに利用可能なRNAiの表現型の検証のためのゴールドスタンダードを提供します。 最後に、検証済みの候補者は最終的には機構的理解を得るために、より詳細に研究されています。多くの場合、RNAiは二次、より精巧なアッセイでは、例えば、これらの実験で使用することができます。

Discussion

RNA干渉は、機能喪失型の表現型を研究するために標準的な技術となっている。 RNAiは、メディエーターの大規模なコレクションは、別の業者から入手可能であり、遺伝子サイレンシングのための簡単​​で、費用対効果が高く迅速な方法を提供しています。これは、異なる種や細胞タイプの広い範囲でのゲノム規模の視点を可能にする多くの生物学的プロセスにおけるキープレーヤーのための体系的なスクリーニングのためのゲートを開けた。

高い偽陽性と偽陰性率は、RNAiスクリーニングにおける共通の課題です。この問題を解決するために、かなりの努力が効果を向上させるために投資し、特にサイレンシングの特異性は、トリガされています。重要な発見は、同じ転写産物をターゲットに異なるsiRNAのプールは非常に標的特異性を高めることだった。異なるsiRNAの非常に複雑なプールがエンドリボヌクレアーゼによって生成されているため、esiRNAsはRNAiスクリーニングの偽陽性率を減少させる、高い標的特異性のトリガーです。 esiRNAsはまたも偽陰性率を低減する、効率的なノックダウンを達成するために示されている。

RNAiスクリーニングの技術的な要求されているため、彼らはおそらくしばらくの間、定期的に実行するために挑戦的なままになります。試薬と器具をより良く、より多くの研究室が自分の専門知識を共有し得るようにしかし、現代生物学におけるRNAiスクリーニングの使用は今後も増加するものとみなされます。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comments
MISSION esiRNA		Sigma-Aldrich		For additional information contact: rnai@sial.com
Wellmate		ThermoScientific
Breathable sealing tape		Corning	Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345)
OptiMEM		Invitrogen
Ethanol		Sigma-Aldrich	E7023	200 proof (absolute), for molecular biology
Phosphate buffered saline		Sigma-Aldrich	P5493	BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride		Sigma-Aldrich	D8417	Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC)
Ribonuclease A from bovine pancreas		Sigma-Aldrich	R6513	For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder
Tris-EDTA buffer solution		Sigma-Aldrich	T9285	100 x, for molecular biology