Summary
Bu araştırma, sıçan kemik iliğinden bol miktarda nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) izole etmek için iki tekniği özetlemektedir. Bir yöntem, ticari bir nötrofil izolasyon kitini yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile birleştirirken, diğeri yalnızca yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeyi kullanır. Her iki yaklaşım da periferik kan nötrofillerinden daha iyi fonksiyonel NET'ler verir.
Abstract
Bu araştırmanın temel amacı, sıçan kemik iliğinden nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET'ler) izole etmek için güvenilir ve etkili bir yaklaşım geliştirmekti. Bu çaba, NET'lerin periferik kandan çıkarılmasına yönelik geleneksel yöntemle ilişkili sınırlamalar nedeniyle, esas olarak izolasyon için mevcut nötrofillerin kıtlığı nedeniyle ortaya çıkmıştır. Çalışma, kemik iliğinden sıçan nötrofilleri elde etmek için iki farklı metodoloji ortaya çıkardı: tatmin edici saflaştırma seviyeleri sağlayan aerodinamik tek aşamalı bir prosedür ve gelişmiş saflaştırma verimliliği sergileyen daha yoğun iki aşamalı bir süreç. Daha da önemlisi, her iki teknik de sıçan başına 50 ila 100 milyon arasında değişen önemli miktarda canlı nötrofil verdi. Bu verimlilik, hem insan hem de fare kaynaklarından nötrofillerin izole edilmesinden elde edilen sonuçları yansıtıyordu. Önemli bir şekilde, sıçan kemik iliğinden türetilen nötrofiller, periferik kandan elde edilen nötrofillerle karşılaştırıldığında, NET'leri salgılamak için karşılaştırılabilir yetenekler sergiledi. Bununla birlikte, kemik iliği bazlı yöntem sürekli olarak hem nötrofillerin hem de NET'lerin önemli ölçüde daha büyük miktarlarda üretildi. Bu yaklaşım, daha sonraki aşağı akış uygulamaları için bu hücresel bileşenlerden önemli ölçüde daha fazla miktarda elde etme potansiyelini göstermiştir. Özellikle, bu izole NET'ler ve nötrofiller, inflamasyon, enfeksiyon ve otoimmün hastalıklar alanlarını kapsayan bir dizi uygulama için umut vaat ediyor.
Introduction
Nötrofiller, doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde çok önemli bir rol oynayan lökositlerin kritik bir alt kümesini oluşturur. Çeşitli proteazlar ve antimikrobiyal peptitler içeren çok loblu çekirdekler ve granüller ile karakterize edilirler1. Nötrofiller öncelikle degranülasyon, fagositoz ve NET oluşumu yoluyla işlev görür. NET'lerin gözlemi ilk olarak 1996 yılında nötrofillerin forbol miristat asetat (PMA)2 ile uyarıldığı bir deney sırasında Takei ve ark. tarafından yapılmıştır. Daha sonra, NET oluşum süreci 2004 yılında Brinkmann ve ark.3 tarafından "NETosis" olarak adlandırılmıştır. Araştırmaları, NET'lerin nötrofil aracılı antimikrobiyal yanıtlardaki önemli rolünü daha da aydınlattı. NET'ler, enfeksiyöz ve enflamatuar uyaranlara yanıt olarak aktive edilmiş nötrofillerden salınan kromatin, histonlar ve antimikrobiyal proteinlerden oluşan ağ benzeri yapılardır. NET'ler, istilacı patojenleri yakalayarak ve yüksek konsantrasyonda antimikrobiyal peptitlere ve proteazlaramaruz bırakarak hareketsiz hale getirebilir ve öldürebilir 1,3. Ek olarak, NET'ler apoptotik hücrelerin temizlenmesine katkıda bulunur ve inflamasyonun çözülmesine katılır. Son çalışmalar ayrıca aşırı NET oluşumunun veya bozulmuş NET bozulmasının doku hasarına, otoimmün bozukluklara, trombogeneze ve bozulmuş revaskülarizasyona yol açabileceğini göstermektedir 4,5,6,7,8,9,10.
Miyokard enfarktüsünü takiben kontrolsüz fibrozis ve ventriküler anevrizmaların oluşumunda NET'lerin patojenik rolü, perivasküler fibrozisin genişlemesi ile gösterilmiştir 4,11. Miyokard enfarktüsü modeli ve farelerde kemik iliğinden nötrofillerin izolasyonu iyi bilinmektedir. İnsan kanında bol miktarda bulunan bir tür beyaz kan hücresi olan polimorfonükleer (PMN) lökositler, insan nötrofillerini izole etmek için mükemmel bir kaynak görevi görür. Bu yöntem, kemik iliği toplama ihtiyacını ortadan kaldırarak güvenliği ve verimliliği artırır.
NET'ler ayrıca kardiyak yeniden şekillenme ile ilişkili atriyal fibrilasyonda da rol oynar. Bununla birlikte, köpekler ve domuzlar gibi büyük hayvanlar, atriyal fibrilasyonu modellemek için kullanıldı, çünkü fareler, belirli iyon kanalları veya sinyal yolları devrilmedikçe veya nakavt edilmedikçe, yeniden giriş döngüsü veya AF modeli oluşturacak kadar büyük bir atriyumdan yoksundur12. Sıçanlarda atriyal fibrilasyonu indüklemek ve daha önce tarif edildiği gibi sıçan periferik kanından nötrofilleri izole etmek mümkün olsa da, araştırmacılar periferik kandan sadece 2 x 105-5 x10 5 nötrofilin izole edilebileceği bir sınırlama ile karşılaştılar (sıçan başına 10 mL). Her zaman noktasında yeterli NET'in çıkarılması yaklaşık 10-25 sıçan (toplamda 5 x 106 nötrofil) gerektirdi, bu da zaman alıcı, pahalı ve genellikle düşük verimli bir süreçlesonuçlandı 13. Bu bağlamda, Li He ve meslektaşları, sıçanlardan yeterli NET elde etmek için kemik iliği odaklı bir strateji sunmaktadır14. Makalelerinde, sıçan kemik iliğinden nötrofillerin izole edilmesinin kapsamlı bir tanımını sunuyorlar ve sıçan periferik ve kemik iliği nötrofillerinin NET salgılama yeteneklerini karşılaştırıyorlar. Özetlenen iki yöntem, her ikisi de gerekli sıçan sayısını azaltırken yeterli miktarda sıçan kemik iliği nötrofili ile sonuçlanan farklı deneysel hedeflere hitap etmektedir. İki aşamalı izolasyon yöntemi, üstün nötrofil saflaştırması gösterirken, tek aşamalı yöntem, kabul edilebilir saflaştırma seviyeleri ile zaman açısından verimli olduğunu kanıtladı. Ayrıca, araştırmacılar sıçan kemik iliği nötrofilleri ile periferik muadilleri arasındaki NETosis ve NET oluşumunu karşılaştırdılar ve PMN ile eşit etki buldular. Bu bulgular, atriyal fibrilasyonun nötrofil ile ilgili çalışmalarına önemli ölçüde katkıda bulunur ve farklı nötrofil dağılımlarına sahip çeşitli deney hayvanlarında nötrofil izolasyonu için farklı kaynakların esnek bir şekilde seçilmesinin önemini vurgular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma, Sichuan Üniversitesi Batı Çin Hastanesi Hayvan Etik Komitesi tarafından verilen bir proje lisansı (No. 20211404A) altında, Sichuan Üniversitesi Batı Çin Hastanesi Hayvan Etik Komitesi'nin hayvanların bakımı ve kullanımı için yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Etik kurallara uygun olarak, bu çalışmada kullanılan sıçanlar, 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü, 22-24 ° C'de sıcaklık ve% 50-60 nem ile kontrollü bir ortamda tutuldu. Sıçanlara yiyecek ve suya ad libitum'a erişim izni verildi. Bu çalışmada kullanılan hayvanlar, yaklaşık 250 g ağırlığında ve spesifik patojen içermeyen 6-8 haftalık Sprague Dawley (SD) erkek sıçanlardı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.
1. Sıçan nötrofillerinin izolasyonu
- Kemik iliği hasadı
- Fareyi anestezi için uygun bir kaba koyun (Malzeme Tablosuna bakınız). Hayvan bilinçsiz olana kadar sıçana% 3 izofluran uygulayın. Anestezi derinliğini sağlamak için ayak parmağı tutamına veya kuyruk tutamına yanıt olup olmadığını kontrol edin.
- Sıçan derin bir şekilde uyuşturulduktan sonra, sıçanı sırtına yerleştirerek ve bir elinizle kuyruğunu tutarken diğer elinizle başını kavrayarak servikal çıkık yapın. Servikal omurga kopana kadar başı aşağı doğru çekerken kuyruğa ani ve güçlü bir yukarı doğru kuvvet uygulayarak boynu hızlı ve sıkı bir şekilde yerinden çıkarın. Doku toplama veya atma işlemine geçmeden önce solunumun durması ve kalp atışı eksikliği gibi ölümün onaylanmasını bekleyin.
- Fareyi% 75 etanole batırın ve kürkü ve cildi sterilize etmek için birkaç dakika bekletin. Fareyi sırt üstü yatırın ve femur başını korumak için kalçadaki alt ekstremiteleri kesin. Diz eklemindeki bağı kesmek için diseksiyon makası kullanın ve femur ve tibiayı ortaya çıkarmak için diz eklemini geriye doğru katlayın.
- Forseps ve makas kullanarak, kemiklere bağlı kasları, tendonları ve diğer dokuları dikkatlice çıkarın. Kalan doku kalıntılarını ve kanı temizlemek için kemikleri Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile durulayın. Toplam üç yıkama için iki kez daha tekrarlayın. Temizlenmiş kemikleri steril bir kaba koyun.
- Kemik iliği matrisini gevşetmek için iliği kemiğin her iki ucundan geçirmek için iğneli 5 veya 10 mL'lik bir şırınga kullanın. Kemik iliğini 10-15 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamıyla başka bir şırınga ile durulayın, görünür kemik iliği temizlenemeyene kadar.
- Kemik iliği hücrelerini 20 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri yeniden süspanse etmek ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe etmek için 5-10 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Karışıma HBSS hacminin 4 katını ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı bir pipetle atın ve elde edilen peleti daha sonra kullanmak için kullanın.
- Nötrofillerin kemik iliğinden izolasyonu
- İki adımlı yöntem için aşağıdaki ek adımları gerçekleştirin:
- Üreticinin talimatlarını izleyerek ticarileştirilmiş sıçan nötrofil izolasyon kitini kullanarak kemik iliği hücrelerini izole edin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Yeni bir 15 mL santrifüj tüpünde 2 mL %55 percoll reaktifi (Malzeme Tablosuna bakınız), 2 mL %65 reaktif, 2 mL %70 reaktif ve 2 mL %80 reaktif katmanlayarak bir yoğunluk gradyanı hazırlayın. Tüpü 800 x g'da 40 °C'de 20 dakika santrifüjleyin, hızlanma 5'e ve yavaşlama 0 veya 1'e ayarlayın.
- Steril bir pipet kullanarak %65 ile %70 gradyan reaktifi arasındaki sınırdaki hücre katmanları da dahil olmak üzere %70 gradyan katmanını toplayın. Hücre süspansiyonunu yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe 15 mL HBSS ekleyin ve hücreleri yıkamak için tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin. Hücreleri peletlemek için tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Tek adımlı yöntem için aşağıdaki ek adımları gerçekleştirin:
- Sıçan nötrofil izolasyon kitini kullanmadan kemik iliği hücrelerini gradyanlara tabi tutun.
- Steril bir pipet kullanarak %65 ile %70 gradyan arasındaki sınırdaki hücre katmanları da dahil olmak üzere %70 gradyan katmanını toplayın. Hücre süspansiyonunu yeni bir 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri HBSS ile yıkayın. Hücreleri peletlemek için tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
- İzole edilmiş nötrofilleri bir hemositometre kullanarak sayın ve tripan mavisi boyama kullanarak canlılığı değerlendirin.
NOT: Protokol, sıçan sayısına ve istenen izole nötrofil sayısına bağlı olarak değiştirilebilir. Bu yöntem yeni bir deney ortamında ilk kez kullanıldığında üç sıçandan kabul edilebilir miktarda kemik elde edilir. Tüm işlemler steril koşullar altında yapılmalıdır. Nötrofillerin kemik iliğinden izolasyonu, hücre hasarını ve canlılık kaybını en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır.
- İki adımlı yöntem için aşağıdaki ek adımları gerçekleştirin:
2. Sıçan NET'lerinin satın alınması
- Steril 10 cm'lik bir Petri kabında 4 mL RPMI ortamında (%10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş) 0.5 x 10 8-1 x 108 izole nötrofilleri yeniden süspanse edin.
- NETosis'i indüklemek için nötrofil süspansiyonuna 500 nM PMA ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. 37 °C ve% 5 CO2'de 3 saat inkübe edin.
- Negatif kontrol için, salgılanan NET'leri parçalamak için nötrofil süspansiyonuna DNaz I (10 U / mL) ekleyin.
- NET'leri toplamak için, ortamı çıkarın ve Petri kabına bağlı NET'leri HBSS ile nazikçe yıkayın. Ardından, NET'leri plakadan ayırmak için her plaka için 4 mL taze ortam ile yoğun yıkama kullanın.
- NET'lerin tamamen yeniden süspansiyonu için yıkama ortamını ve pipeti sık sık toplayın.
- Yüzen hücreleri çıkarmak için süspansiyonu 300 × g'da 10 dakika boyunca 20 °C'de santrifüjleyin.
- NET'leri içeren süspansiyonu steril bir tüpe aktarın ve 2 hafta içinde daha sonra kullanmak üzere −20 °C'de saklayın.
NOT: NET'ler bozulmaya karşı hassastır, bu nedenle en iyi sonuçlar için taze hasat edilmiş malzeme kullanılması önerilir.
3. NET'lerin varlığının doğrulanması
- Hücreleri (adım 2.4'ten itibaren) 15 dakika boyunca %4 paraformaldehit içeren lamellere ve 30 dakika ila 1 saat boyunca NET'lere (adım 2.7'den itibaren) sabitleyin.
- Lameli parafin film kaplı bir test tüpü standı üzerindeki bir PBS / PBST damlacığı üzerine ters çevirin ve yıkama işlemini her biri 5 dakika boyunca üç kez tekrarlayın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 0.5 Triton-X-100 ile geçirgen hale getirin ve her biri 1 dakika boyunca PBS / PBST'de üç kez yıkayın. Hücreleri% 10 normal eşek serumu ile kapatın (Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 1 saat boyunca.
- Hücreleri, sıçan önleyici nötrofil elastaz antikoru ve sıçan önleyici miyeloperoksidaz antikoru (Malzeme Tablosuna bakınız) ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Ardından, lameli PBS/PBST'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Hücreleri ikincil antikor A488-konjuge eşek anti-tavşan IgG (H + L), A594-konjuge eşek anti-fare IgG (H + L) ve A594-konjuge keçi anti-Fare IgG1 (bkz. Malzeme Tablosu) ile oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat inkübe edin. Ardından, lameli PBS/PBST'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Hücre çekirdeklerini ve NET iskeletlerini 10 mg/mL DAPI ile boyayın. Ardından, lameli PBS/PBST'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Bir cam kızak üzerine bir damla montaj ortamı yerleştirin ve lamel üzerine hücrelerle birlikte ters çevirin. Daldırma lensleriyle mikroskobik analiz için 1 saat kurumasını bekleyin; aksi takdirde incelemeye hazırdır.
NOT: NET'leri manipüle ederken, fiksasyondan sonra bile çok dikkatli olunmalıdır, çünkü bunlar son derece kırılgandır ve hazırlık sırasında kolayca kaybolabilir.
4. NET'lerin Sayılarının Belirlenmesi
- Tris-EDTA (TE) tamponu ve PicoGreen (dsDNA tahlil reaktifi) çalışma solüsyonunu üreticinin talimatlarına göre hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Stok DNA'yı 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL ve 1 μg/mL konsantrasyonlarına seyrelterek standartlar hazırlayın.
NOT: NET'lerin konsantrasyonunu ölçmek için, üreticinin yönergelerine bağlı kalınarak dsDNA test kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılmıştır. Tris-EDTA (TE) tamponu ve dsDNA tahlil reaktifleri, sırasıyla 19 kat hacimde çift damıtılmış su veya 199 kat hacimde TE tamponu kullanılarak hazırlandı. Daha sonra standart çözeltiler (1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL ve 1 μg/mL) hazırlandı ve numunenin her 50 μL'si 450 μL TE tamponu ile birleştirildi. - 450 μL TE tamponuna her numuneden 50 μL ekleyin.
- Standartlar ve numuneler dahil olmak üzere 96 oyuklu bir plakadaki her bir oyuğa eşit hacimde tahlil reaktifi çalışma çözeltisi ile birlikte 100 μL standart veya numune ekleyin.
- Plakayı oda sıcaklığında 2-5 dakika inkübe edin, doğrudan ışıktan kaçının.
- Yaklaşık 530 nm'lik bir emisyon spektrumuna ve yaklaşık 480 nm'lik bir absorbans spektrumuna sahip bir floresan mikroplaka okuyucu kullanarak numuneleri okuyun.
- Standartlar tarafından oluşturulan standart eğriyi kullanarak her numunedeki NET konsantrasyonunu hesaplayın.
5. NET sekresyonunun hücre sitometrisi ile analizi
- 10 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 96 oyuklu plakada inkübe edilen hücrelere çekirdek boyası ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 30 dakika inkübe edin.
- 300 nM'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için hücrelere hücresiz DNA (cfDNA, Malzeme Tablosuna bakınız) boyası ekleyin ve 10 dakika inkübe edin.
- Floresan boyaları hafif pipetleme ile karıştırın. Süpernatanı atmayın veya peleti yıkamayın.
- S'yi yükleyinamples sitometre cihazına plaka.
- Farklı kanallar için odak ve pozlama süresi parametrelerini ayarlayın: mavi (örn: 377/50 nm, em: 470/22 nm), genellikle 30.000 ms pozlama ile, yeşil (örn: 483/32 nm, eM: 536/40 nm) genellikle 5.000 ms pozlama ile.
- Farklı kanallarda tüm plakanın son derece homojen görüntülerini yakalayın.
- Farklı gruplar için çekirdek boyama sayılarını analiz edin. Benzerlerse, NET sekresyonu cfDNA leke sayısı ile belirlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada özetlenen protokol, her biri geliştirilmiş saflaştırma veya kolaylaştırılmış adımlarla karakterize edilen iki farklı yöntemi tanımlar. Her iki yöntem de sıçan başına yaklaşık 0.5 x 108-1 x 108 nötrofil verdi. Annexin V-FITC/PI apoptoz tespit kitini kullanan akış sitometrisi analizi, fare ve insan muadilleriyle karşılaştırılabilir şekilde %90'ın üzerinde hücre canlılığı sergiledi (Şekil 1). Kemik iliğinden nötrofil izolasyonu sırasında lenfosit kontaminasyonu kaçınılmaz gibi görünse de, iki aşamalı yöntem, tek aşamalı yöntemle elde edilen %50'ye kıyasla %90'lık gelişmiş bir saflık seviyesi göstermiştir (Şekil 2).
NET sekresyonunda karşılaştırılabilir yanıtlar, PMA stimülasyonundan bağımsız olarak periferik ve kemik iliği nötrofilleri arasında fark edilebilirdi (Şekil 3). Ayrıca, sıçan NET'leri birbirleriyle sınırlı çapraz bağlanma yetenekleri sergilemiştir (Şekil 4). Sıçan NETosis sürecini daha derinlemesine incelemek amacıyla, PMA bir indükleyici olarak kullanıldı. NET'ler cfDNA boyama yoluyla tespit edildi ve bir Hücre Görüntüleme Analizörü kullanılarak kapsamlı görüntüler yakalandı. Özellikle, sıçan nötrofilleri, dış stimülasyon olmadan bile, fare ve insan nötrofillerinin aksine, spontan NETosis için daha yüksek bir eğilim sergiledi. PMA ile inkübasyon, 4 saat sonra cfDNA içeriğinde %10'luk bir artışa yol açtı (Şekil 5). 500 nM PMA'ya maruz kaldığında, her sıçanın kemik iliği 8-12 μg / mL NET-DNA'lık bir nihai konsantrasyon verdi. NETosis sırasında hücre içi içeriğin sıçan nötrofillerinde eksik ekstrüde edilmesi ve bunun sonucunda çok sayıda hücre içi bileşenin gözlemlenmesi dikkat çekicidir. Ek olarak, sıçan NET'leri, gelişmiş yapışma eğilimleri nedeniyle gazlı bez benzeri bir film oluşturma eğilimi sergiledi ve belirgin bir bulut benzeri görünüm sundu.
Şekil 1: Kemik iliği izolasyonundan nötrofil canlılık değerlendirmesi. Sıçan nötrofil izolasyonu için en uygun kaynak, sonraki nötrofil hücre dışı tuzak edinimini kolaylaştıran kemik iliğidir. Bu rakam He ve ark.14'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Wright-Giemsa boyaması ile periferik kan ve kemik iliğinden nötrofil saflaştırması. (A) Periferik kan kaynağı. (B) Tek adımlı yöntemle kemik iliği orijini. (C) İki aşamalı yöntemle kemik iliği orijini . Kemik iliği ekstraksiyonu, sıçan nötrofil izolasyonu ve ardından nötrofil hücre dışı tuzakların edinilmesi için tercih edilen yaklaşım olarak hizmet eder. Ölçek çubuğu = 20 μm. Büyütme = 400x. Bu rakam He ve ark.14'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PMA veya PMA + DNaz I ile inkübasyon üzerine NET sekresyonu. Kemik iliği ekstraksiyonu, sıçan nötrofil izolasyonu ve ardından nötrofil hücre dışı tuzakların toplanması için tercih edilen yolu temsil eder. Bu rakam He ve ark.14'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İmmünofloresan analizi. Çekirdeğin immünofloresan boyanması (mavi, A), MPO (yeşil, B) ve birleştirme görüntüsü (C). NET: Nötrofil Hücre Dışı Tuzak; MPO: Miyeloperoksidaz. Kemik iliği ekstraksiyonu, sıçan nötrofil izolasyonu ve ardından nötrofil hücre dışı tuzakların toplanması için tercih edilen yöntemdir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Büyütme = 200x. Bu rakam He ve ark.14'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Çeşitli koşullar altında hücre görüntüleme analizörü aracılığıyla cfDNA'nın kapsamlı analizi. cfDNA (yeşil) ve çekirdeğin (mavi) floresan boyanması. Kemik iliği ekstraksiyonu, sıçan nötrofil izolasyonu ve ardından nötrofil hücre dışı tuzakların toplanması için birincil yaklaşımdır. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakam He ve ark.14'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nötrofillerin izolasyonu, güvenilir sonuçlar elde etmek için uygun bir izolasyon yönteminin seçilmesinin çok önemli olduğu NETosis çalışmasında çok önemli bir adım oluşturur. Tartılması gereken önemli bir faktör, izolasyon sırasında lenfosit kontaminasyonunun meydana gelmesidir. Bu zorluğun ele alınması, sıçan nötrofillerini kemik iliğinden izole ederken özellikle önemlidir. Lenfositlere (1.0337-1.0765, 1.0526'da bir zirve ile) kıyasla nötrofillerin farklı yoğunluk aralığına (1.0814-1.0919, 1.0919'da bir zirve) rağmen, lenfositlerle kontaminasyon kaçınılmazdır. Bu kısmen kemik iliğindeki lenfositlerin bolluğuna ve olgunlaşmamış lenfositlerin artan yoğunluğunabağlanabilir 15. Percoll ve Ficoll kullanımı gibi yoğunluk gradyan ayrımı gibi teknikler, lenfosit kontaminasyonunun engellenmesine yardımcı olabilir, ancak tam lenfosit eliminasyonunun sağlanması zor olabilir. Belirli bir yoğunluk gradyanına kalibre edilmiş özel bir Percoll çözeltisi, sıçan nötrofilleri ve diğer kemik iliği hücreleri arasındaki yoğunluk farkından yararlanarak kontaminasyonu en aza indirmek için kullanılabilir. Bu nedenle, araştırmacılar lenfosit kontaminasyonunun deneysel sonuçları üzerindeki potansiyel etkisini makul bir şekilde değerlendirmeli ve etkisini azaltmak için önlemler almalıdır.
Bu çalışma, izolasyon yöntemlerinin belirli deneysel gerekliliklere uyacak şekilde uyarlanmasının önemini vurgulamaktadır. Daha önce14 tanımlanan yöntemde, tek adımlı yöntem, zaman ve çaba açısından daha az talepkar olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, kontamine lenfositlerin NET sekresyonu üzerindeki önemsiz etkisi nedeniyle NET edinimi için onaylanmıştır. Bu lenfositler daha sonra son santrifüj aşamasında elimine edilebilir. Tersine, nötrofil izolasyonu ve daha sonra NETosis ve NET sekresyonunun değerlendirilmesini gerektiren çabalar için iki aşamalı yöntem önerilmiştir14. Bu yaklaşım, nötrofiller tarafından üretilen NET'lerin hassas bir şekilde ölçülmesine izin verirken, diğer hücre kontaminasyonlarından kaynaklanan potansiyel karıştırıcı faktörlerin etkisini en aza indirdi.
Hem verimi hem de saflığı artırmak için izolasyon protokolünde değişiklikler yapılabilir. Örneğin, optimize edilmiş bir yoğunluk gradyan reaktif setinin kullanılması daha fazla nötrofil verebilir. Nazik pipetleme ve yıkama yöntemleri de aynı şekilde hücre kaybını azaltabilir ve saflığı artırabilir. Santrifüj parametrelerinin ayarlanmasının yanı sıra tampon pH'ı ve sıcaklığının izlenmesi gibi sorun giderme eylemleri, izolasyon işlemi sırasında karşılaşılan zorlukları etkili bir şekilde ele alabilir. Kemik iliği izolasyonunun ilişkili bir kısıtlaması, olgunlaşmamış nötrofil ve diğer kemik iliği hücre kontaminasyonu olasılığında yatmaktadır, bu nedenle hem saflığı hem de verimi etkiler. Lenfositleri dışarı atmak için aerodinamik bir yaklaşım geliştirmek, genel izolasyon verimliliğini artırabilir. Diğer bir kısıtlama, in vivo sıçan nötrofilleri üzerinde uzunlamasına araştırmalar için uygun olmayabilecek kemik iliği izolasyonu için hayvan kurban etme gerekliliği ile ilgilidir.
İnsanlar için nötrofil izolasyonu ağırlıklı olarak periferik kana dayanır. Konvansiyonel yöntemler Ficoll-Paque, Percoll ve immünomanyetik boncuk ayrımını kapsar 16,17,18. Ficoll yaklaşımı, lökosit popülasyonlarını kaldırma kuvvetine göre ayırır ve nötrofilleri ayırt etmek için bir kontrast maddeye dayanır. Basitlik ve maliyet etkinliği sunar, ancak saflık ve verimden ödün verir ve kırmızı kan hücrelerinin ortadan kaldırılmasında zorluklar sunar. Öte yandan, Percoll yoğunluk gradyanlarından yararlanarak, özel ekipman pahasına daha fazla nötrofil saflığı ve verimi sağlar ve artan masraflar ve zaman19. İmmünomanyetik boncuk ayrımı, diğer lökositlerden minimum kontaminasyon ile nötrofillere spesifik olarak bağlanan antikor konjuge manyetik boncukları kullanan daha yeni, daha spesifik bir tekniktir. Otomasyona uygun olmasına rağmen, özel ekipman gerektirir ve boncuk giderleri nedeniyle daha yüksek maliyetlere neden olur. Bir nötrofil izolasyon yöntemi seçerken, araştırmacılar verimi, saflığı, maliyeti ve karmaşıklığı tartmalıdır. Şu anda, insan nötrofil izolasyonu için en uygun yöntem PolymorphPrep20'nin kullanılmasını içerir. Bu yaklaşım, kısa bir süre içinde önemli miktarlarda yüksek oranda saflaştırılmış nötrofiller verir. PolymorphPrep'in prensibi, yoğunluğa göre hücre ayrımına dayanır.
Farelerde, nötrofillerin periferik kandan izole edilmesi, düşük kan hacimleri ve aşağı akış deneyleri için yeterli miktar ve saflığın sağlanmasının zorluğu nedeniyle tavsiye edilmez. Sıçanların yeterli kan miktarları sağlamasına rağmen (sıçan başına 10 mL), periferik kan özellikleri insanlardan ve farelerden farklıdır. Sıçanlar doğal olarak nötrofil ekstraksiyonunda eksiklikler sergilerler, monositler en bol çekirdekli hücrelerdir13,14. Bu nedenle, periferik kan izolasyonu, tek bir sıçandan sadece 2 x 105-5 x 105 nötrofil sağlar. Kemik iliği, hayvanın enfeksiyon durumundan bağımsız olarak kolayca bulunabilen ve bol miktarda tedarik sağlayan daha canlı bir nötrofil kaynağı olarak hizmet eder. Alternatif olarak, izolasyon için nötrofil infiltrasyonunu arttırmak için karın boşluğunda veya toraksta enflamatuar bir ortamın indüklenmesi güvenilmez ve karmaşıktır. Bu nedenle, kemik iliği ekstraksiyonu, sıçan nötrofil izolasyonu için pratik ve güvenilir bir yol olarak ortaya çıkmaktadır21.
NETosis, DNA dekonsülasyonu, otofaji ve hücre içi matriks atılımını kapsayan çeşitli hücresel süreçleri içerir1. İnsanlarda, NET ekstrüzyonu kapsamlıdır ve hücre zarının kalıntılarını geride bırakır. Şaşırtıcı bir şekilde, sıçan nötrofil çalışmaları, stimülasyon sonrası daha fazla hücre içi içeriği ortaya çıkaran farklı modeller sergiler. PMA stimülasyonuna rağmen, sıçan nötrofilleri, spontan NETosis ile uyumlu olarak eksik NET ekstrüzyonu sergiler. İlginç bir şekilde, sıçan NET'leri, potansiyel olarak çapraz bağlama yeteneğinin azalması nedeniyle, kapsamlı ağ yapısından ziyade toplu formlar (aggNET'ler) için bir eğilim göstermektedir. Bu fenomen, sıçanlarda daha geniş bağışıklık tepkisini etkileyerek nötrofil agregasyonunu önemli ölçüde etkileyebilir. Kemik iliği izolasyonunun gelecekteki uygulamaları, NETosis'te farklı sinyal yolaklarının ve bağışıklık hücrelerinin araştırılmasını içerebilir. Ek olarak, bu yöntem, nötrofillerin farklı patolojilerdeki rollerini çözerek çeşitli hastalık modellerinde NETosis eksplorasyonunu kolaylaştırabilir. Sonuç olarak, NET'leri izole etmek ve karakterize etmek için kullanılan yeni teknikler, NETosis'i yönlendiren mekanizmaları ve çeşitli hayvan modellerindeki işlevsel etkilerini çözmek için umut vaat etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Finansman: Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82004154, 81900311, 82100336 ve 81970345) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al.
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
