Summary
Denne protokol bruger lysbilleddannelse til at undersøge hjertekontraktil funktion hos zebrafisklarver og få indsigt i hjertemekanik gennem cellesporing og interaktiv analyse.
Abstract
Zebrafisk er en spændende modelorganisme kendt for sin bemærkelsesværdige hjerteregenereringskapacitet. At studere det kontraherende hjerte in vivo er afgørende for at få indsigt i strukturelle og funktionelle ændringer som reaktion på skader. Det er dog stadig udfordrende at opnå højopløselige og hurtige 4-dimensionelle (4D, 3D rumlige + 1D tidsmæssige) billeder af zebrafiskens hjerte for at vurdere hjertearkitektur og kontraktilitet. I denne sammenhæng bruges et internt lysarkmikroskop (LSM) og tilpasset beregningsanalyse til at overvinde disse tekniske begrænsninger. Denne strategi, der involverer LSM-systemkonstruktion, retrospektiv synkronisering, enkeltcellesporing og brugerrettet analyse, gør det muligt at undersøge mikrostrukturen og kontraktilfunktionen på tværs af hele hjertet ved enkeltcelleopløsningen i de transgene Tg (myl7: nucGFP) zebrafisklarver. Derudover er vi i stand til yderligere at inkorporere mikroinjektion af små molekyleforbindelser for at fremkalde hjerteskade på en præcis og kontrolleret måde. Samlet set giver denne ramme mulighed for at spore fysiologiske og patofysiologiske ændringer såvel som den regionale mekanik på enkeltcelleniveau under hjertemorfogenese og regenerering.
Introduction
Zebrafisken (Danio rerio) er en meget anvendt modelorganisme til studier af hjerteudvikling, fysiologi og reparation på grund af dens optiske gennemsigtighed, genetiske trækbarhed og regenerative kapacitet 1,2,3,4. Efter myokardieinfarkt, mens strukturelle og funktionelle ændringer påvirker hjerteudstødning og hæmodynamik, hindrer tekniske begrænsninger fortsat evnen til at undersøge den dynamiske proces under hjerteregenerering med den høje rumlige tidsopløsning. For eksempel har konventionelle billeddannelsesmetoder, såsom konfokal mikroskopi, begrænsninger med hensyn til billeddybde, tidsmæssig opløsning eller fototoksicitet til at fange de dynamiske ændringer og vurdere hjertekontraktil funktion under flere hjertecyklusser5.
Lysarkmikroskopi repræsenterer en avanceret billeddannelsesmetode, der med succes løser disse problemer ved hurtigt at feje laseren over hjertets ventrikel og atrium og opnå detaljerede billeder med forbedret rumlig tidsopløsning og ubetydelig fotoblegning og fototoksiske effekter 6,7,8,9,10,11.
Denne protokol introducerer en omfattende billeddannelsesstrategi, der inkluderer LSM-systemkonstruktion, 4D-billedrekonstruktion, 3D-cellesporing og interaktiv analyse for at fange og analysere dynamikken i kardiomyocytter på tværs af hele hjertet under flere hjertecyklusser12. Det tilpassede billeddannelsessystem og beregningsmetode gør det muligt at spore myokardiemikrostrukturen og kontraktilfunktionen på enkeltcelleniveau i transgene Tg (myl7: nucGFP) zebrafisklarver. Desuden blev små molekyleforbindelser leveret til embryonerne ved hjælp af mikroinjektion for at vurdere lægemiddelinduceret hjerteskade og efterfølgende regenerering. Denne holistiske strategi giver et indgangspunkt til in vivo at undersøge strukturelle, funktionelle og mekaniske egenskaber af myokardium på enkeltcelleniveau under hjerteudvikling og regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Godkendelse af denne undersøgelse blev givet af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Texas i Dallas under protokolnummer # 20-07. Tg(myl7:nucGFP) transgene zebrafiskelarver12 blev anvendt til denne undersøgelse. Al dataindsamling og billedefterbehandling blev udført ved hjælp af open source-software eller platforme med forsknings- eller uddannelseslicenser. Ressourcerne er tilgængelige fra forfatterne efter rimelig anmodning.
1. Zebrafiskavl og embryomikroinjektion
Tidspunkt: 2 dage
- Vedligehold og opdræt voksne zebrafisk gennem standardpleje og avlsprocedurer. For detaljerede metoder henvises til tidligere rapport13.
- Udfør mikroinjektion i henhold til den etablerede protokol14. Til denne undersøgelse blev mikroinjektion udført på 1-2 celle (zygote) stadiet.
BEMÆRK: Det er afgørende nøjagtigt at identificere dette trin for effektiv mikroinjektion og for at sikre udviklingskonsistens. I løbet af encellestadiet dannes en lille kuppel oven på æggeblommen, og dette trin varer typisk ca. 12 min. Efter fremskridt til tocellestadiet bliver to tilstødende kupler synlige, og dette stadium varer i ca. 45 minutter efter befrugtning15. Mere detaljerede oplysninger om systemkonstruktion findes i andre rapporter eller protokoller 12,16,17.
2. Tilberedning og montering af zebrafiskembryoner/larver
Tidspunkt: 7 dage
- Overfør embryoner 1 dag efter befrugtning (dpf) til E3-vand med 0,2 mM 1-phenyl-2-thiourea (PTU) (se materialetabel) for at forhindre pigmentdannelse.
- Udskift mediet med frisk E3-vand med PTU hver dag indtil LSM-billeddannelse.
- Billede embryoner eller larver med stereomikroskopet for at registrere deres udvikling på de ønskede tidspunkter mellem 0 og 7 dpf.
- Forbered segmenterede fluorerede ethylenpropylenrør (FEP) med 2 mm indvendig diameter til indlejring af zebrafisklarver under LSM-systemet12.
BEMÆRK: FEP-røret bruges til at sikre prøven med brydningsindeksmatchende materialer, der ligner det omgivende medium, såsom vand. - Start fra 3 dpf, overfør fisk til en 150 mg / L tricain (MS-222) opløsning (se materialetabel) for at immobilisere fisk før billeddannelse.
- Der fremstilles 0,8 % lavsmeltende agarose med 150 mg/l tricain, og brug en overførselspipette til at flytte bedøvet fisk til agarose, når den er afkølet til stuetemperatur18.
- Brug en anden overførselspipette til at montere fisken med agarose i FEP-rør (figur 1).
BEMÆRK: For at fastslå den minimale stress i de udviklende embryoner blev præ- og postfikseringsundersøgelser af hjerteaktivitet, såsom hjertefrekvens, udført under mikroskopisk observation. Disse vurderinger havde til formål at identificere eventuelle signifikante forskelle før og efter tricainbedøvelse. En yderligere undersøgelse af hud og muskulatur for uregelmæssigheder i hjertestrukturen, såsom ødem, kunne også udføres efter fiksering. Koncentrationen af tricain spiller også en afgørende rolle i hjertebilleddannelse19, og derfor blev 150 mg/L koncentrationstricainopløsningen anvendt til billeddannelse af sammentrækning hos zebrafiskelarver i dette projekt. Mens den nuværende retrospektive synkronisering giver os mulighed for at adressere de uregelmæssige hjerteslag20, er en omfattende løsning til 4D-billeddannelse af hjertearytmier og langtidsbilleddannelse hos zebrafisk stadig under udvikling.
3. Opsætning og konfiguration af lysbilledbehandlingssystem
Tidspunkt: 3-14 dage
- Konstruer et internt LSM-system baseret på en cylindrisk linse ved hjælp af kontinuerlige bølgediodepumpede faststoflasersystemer (DPSS) ved specifikke bølgelængder såsom 473 nm og 532 nm som belysningskilder (figur 2A).
- Tilpas LabVIEW-kontrolkoder (se materialetabel) til synkronisering af translationelt prøvetrin, lysarkbelysning og eksponering af sCMOS-kamera for at optage billedsekvenser.
BEMÆRK: Mere detaljerede oplysninger om systemkonstruktion kan findes i andre rapporter eller protokoller 12,16,17. Vi opfordrer forskningsgrupper til at søge samarbejdsmuligheder med laboratorier, der besidder etableret ekspertise inden for optisk billeddannelse under systemkonstruktion.
4. Forberedelse af billeddannelse af zebrafisk og dataindsamling
Tidspunkt: 1 dag
- Kalibrer LSM-systemets rumlige opløsning, og minimer opacitetsvariationen i forskellige dybder ved at måle fluorescensperler.
- Først fortyndes fluorescerende perler (se materialetabellen) med en diameter på 0,53 μm til en koncentration på 1: 1,5 x 105 under anvendelse af 0,8 % lavsmeltende agarose, og opløsningen overføres til det segmenterede FEP-rør.
- For det andet skal du bruge LSM-systemet til at afbilde perlerne og måle punktspredningsfunktionen (PSF) over hele prøven, validere den rumlige opløsning og systemjustering12.
BEMÆRK: I dette system indikerer analysen af repræsentative resultater for fuld bredde ved halv maksimum (FWHM) laterale og aksiale opløsninger på henholdsvis 1,26 ± 0,15 og 2,48 ± 0,15 μm (n = 60 perler). Dette tyder på en konsistent rumlig opløsning i hele billeddybden.
- Fastgør FEP-røret med monteret zebrafisklarve sikkert til det 6-aksede (x, y, z, pitch, yaw og roll) motoriserede prøvetrin, og nedsænk rørene i prøvekammeret fyldt med E3-vand. For at undgå lysspredning af blommesækken og bedre lokalisere hjertets position skal du dreje zebrafisklarven for at tage billede fra den ventrale side (figur 2B). I dette tilfælde vil de fleste optagne billeder omfatte både ventrikel og atrium (figur 2C).
BEMÆRK: Da de nuværende billeddannelsesprocedurer typisk varede mindre end en time pr. fisk og blev udført i et kontrolleret rumtemperaturmiljø, anses kammertemperaturregulering og iltniveauregulering for valgfri for dette projekt. For længerevarende timelapse-billeddannelsesundersøgelser, navnlig dem, der fokuserer på udviklingsprocesser, foreslås det imidlertid kontinuerlig temperaturovervågning og regulering ved 27 °C i prøvekammeret for at sikre zebrafiskens fysiologiske miljø og forhindre potentielle udviklingsabnormiteter. - Tilslut det motoriserede prøvetrin til arbejdsstationen, og konfigurer alle nødvendige parametre, herunder den ønskede bevægelsestilstand.
- Opret forbindelse mellem sCMOS-kameraet og arbejdsstationen. Juster alle vigtige indstillinger, såsom en eksponeringstid på 5 ms og det ønskede interesseområde.
- Konfigurer antallet af billedsekvenser og billeder i det tilpassede LabVIEW-kontrolprogram.
- Tænd laseren, og start LSM-billeddannelse af prøven. Bevar processen, indtil alle billedsekvenser er blevet optaget.
- Optag 300 billeder som en 2D-billedsekvens for at dække 3-5 hjertecyklusser af larven med en billedhastighed på 200 billeder / sekund. Optagelsen fanger hjertets kontraktilitet på det selektive plan, der oplyses af lysarket.
- Flyt larven i trinstørrelsen på 1 μm hen over lysarkets belysning for praktisk talt at skære prøven.
BEMÆRK: Prøvetrinnets trinstørrelse skal indstilles ud fra lysarksystemets aksiale opløsning efter Nyquist-Shannons prøvetagningssætning12. - Gentag trin 7 for at optage endnu en billedsekvens af den nye prøveskive, indtil hele hjertet er dækket. Generelt sikrer 100-200 billedsekvenser med trinstørrelsen 1 μm dækningen af hele hjertet af en zebrafisklarve (figur 2D).
BEMÆRK: Trin 4.7-4.9 styres af LabVIEW-programmet og udføres automatisk af LSM-systemet (figur 3). I betragtning af den omfattende mængde billeddata, der genereres, anbefales en standardiseret navngivningskonvention for billedsekvenser. Du kan f.eks. angive mapper med navne som "z-1", "z-2" osv. for at kategorisere data på tværs af forskellige billedsekvenser. Inden for hver sekvens skal billederne navngives sekventielt (f.eks. "1", "2", ...) for at angive forskellige tidspunkter. Den samlede tid til montering af fisk, justering af billedvinklen og indsamling af alle data for en zebrafisklarve er omkring 1 time.
5. 4D-billedrekonstruktion med parallel beregning
Tidspunkt: 1 dag
BEMÆRK: 4D-rekonstruktionsalgoritmen udviklet af vores gruppe og prøvedata er offentligt tilgængelige21. Denne metode gør det muligt at rekonstruere 4D-hjertebilledet ud fra billedsekvenserne indsamlet i tidligere trin (tabel 1).
- Åbn filen test_Parallel.m i MATLAB (se materialetabel). Angiv mappeplaceringen, hvor de rå billedsekvenser er gemt i variablen "baseDir".
- Tildel variablen "numOfSlice" med det samlede antal billedsekvenser (typisk 100-150) og variablen "numOfImage" med antallet af billeder (typisk 300-500) i hver sekvens.
- Undersøg billedsekvensen, der viser zebrafiskens hjertes midterplan (for eksempel den 51. sekvens ud af 101 samlede sekvenser). Identificer rammenumrene for den første og fjerde systoler i denne sekvens, og tildel dem til variablerne systolicPoint_1st og systolicPoint_4th.
- Klik på Kør for at starte processen.
BEMÆRK: Længden af hjertecyklussen i hver billedsekvens identificeres først af MATLAB-programmet gennem en sammenligning af ligheden (summen af kvadrerede forskelle) mellem billeder på forskellige tidspunkter. Derefter estimeres hjertecyklussen ved hjælp af gennemsnittet af cykluslængderne fra alle billedsekvenser. Dernæst justeres startpunkterne for billedsekvenser på forskellige aksiale placeringer af programmet gennem en iterativ sammenligning af billedligheden fra den første billedsekvens til den sidste billedsekvens. - Kontroller resultaterne i outputmappen. Programmet gemmer billederne som ".tif" filer med tidsstempler. Hver ".tif" -fil er et 3D-hjertebillede på et bestemt tidspunkt. Tidsintervallet mellem to 3D-billeder er lig med den indstillede eksponeringstid.
BEMÆRK: Rekonstruer de erhvervede billeder fra de foregående trin for at skildre 4D (3D rumlige + 1D tidsmæssige) hjertesammentrækninger. For at forbedre færdighederne i undersøgelser med højt gennemløb under retrospektiv synkronisering muliggør denne tilgang samtidige beregningshandlinger på en GPU ved at udnytte flere CPU-kerner gennem MATLAB-værktøjskassen til parallel databehandling og omdanne billeder til gpuArray-formatet.
6. 3D cellesegmentering og cellesporing
Tidspunkt: 1 dag
- Download 3DeeCellTracker-pakken (se materialetabellen), og opsæt Python-miljøet22.
- Download ITK-SNAP-annotationssoftware23 (se materialetabel), og brug den til manuelt at mærke 3D-hjertebilledet i to valgte tidspunkter, den ene ved ventrikeldiastolen og den anden ved ventrikelsystolen, for at oprette trænings- og valideringsdatasæt.
BEMÆRK: Anden mærkningssoftware kan også være gældende. - I Python skal du køre 3DeeCellTracker-træningsprogrammet og initialisere parametrene noise_level(100 i dette tilfælde), folder_path og model i funktionen TrainingUNet3D for at indstille den foruddefinerede 3D U-Net-model.
- I MATLAB skal du bruge imageDimConverter.m-programmet til at konvertere og omdøbe trænings- og valideringsdatasættet til det korrekte format til indlæsning.
- I Python skal du indlæse trænings- og valideringsdatasættene ved hjælp af funktionerne trainer.load_dataset() og trainer.draw_dataset().
- I Python skal du køre den første del af 3DeeCellTracker-sporingsprogrammet og initialisere parametrene.
BEMÆRK: Dette omfatter definition af billedparametre til karakterisering af billeddimensioner, segmenteringsparametre til valg af den maskinlæringsmodel, der anvendes til cellesegmentering, og sporingsparametre til valg af de forudtrænede dybe neurale netværksmodeller, der anvendes til celleregistrering. For første gang anbefales det at anvende U-Net-modellen til cellesegmentering og FFN + PR-GLS til celleregistrering. Det er nødvendigt at gemme data, model og resultater i mapper, der automatisk oprettes i dette trin. - I MATLAB skal du bruge imageDimConverter.m-programmet til at konvertere og omdøbe alle 3D-hjertebilleder til det korrekte format og overføre dem til datamappen, der blev oprettet i det sidste trin.
- I Python skal du køre den anden del af 3DeeCellTracker-programmet for at starte segmentering.
- Når det første 3D-billede er segmenteret, skal du sammenligne segmenteringsresultatet med raw-billedet og udføre manuel korrektion, hvis der findes en forkert segmentering. Flyt den rettede segmentering til den oprettede mappe "/manual_vol1".
- I Python skal du køre den tredje del af 3DeeCellTracker-programmet for at segmentere alle billederne.
- Brug Amira (se materialetabellen) til at udføre en visuel vurdering af sporingsresultater ved at sammenligne positionerne for sporede celler med deres tilsvarende råbilleder. Hvis testresultaterne ikke er tilfredsstillende, skal du genoptage proceduren fra trin 6.6, anvende en alternativ model til maskinel indlæring til segmentering eller celleregistrering og derefter starte sporingsprocessen igen.
BEMÆRK: Efter segmenteringen gemmes dataene for celleetiketter som standard som et 8-bit billede (0 til 255), hvilket betyder, at kun 256 skalaer leveres som etiketter til celleklassificering. Der er to løsninger til at løse dette problem, når der er behov for yderligere klasser. En løsning er at indstille formatet af data for celleetiketter som et 16-bit billede i sporingsprogrammet, hvilket vil medføre en eksponentiel stigning i behandlingstiden, mere end to dage i det foreliggende tilfælde. Den anden løsning er at bruge programmet "separateTrackingResults.py" til efterbehandling af celleetiketterne, som adskiller celler med de samme etiketter baseret på deres fysiske placering og tildeler hver celle en anden etiket. Denne proces tager omkring 10 minutter i dette tilfælde.
7. Hjertekontraktilitetsanalyse i virtual reality-tilstand
Tidspunkt: 1 dag
- Hent cellesporingsresultatet fra tidligere trin.
- Valider dataene manuelt, og markér celler med ensartet billedintensitet på tværs af alle diskenheder (ca. 500 celler ud af ca. 600).
- Brug cellLabelsToObj.ipynb-script 21 til at generere et overfladenet for hver enkelt celle via 3D Slicer-software24 (se Materialetabel), og tildel en entydig farvekode til hver celle.
- Eksportér hver 3D-model, der består af alle celler i et enkelt tidspunkt, som en enkelt .obj fil, der består af flere underobjekter ledsaget af en .mtl-fil for at beskrive celleetiketten.
- Importer modellerne til Unity ved hjælp af uddannelseslicensen, en udviklingsmotor, der bruges til udvidet virkelighed.
- Anvend de tilpassede scripts, der består af funktioner skrevet i C # til modellerne og brugergrænsefladeelementerne for at muliggøre 4D-visualisering og interaktiv analyse. Udfør VR-interaktion ved at følge trin 7.7.
- Interager med modellerne i virtual reality (VR) ved hjælp af følgende funktioner (figur 4):
- Cellemarkering: Vælg op til to celler ad gangen, og se deres baner, hastigheder, volumener, overfladearealer og relative afstande.
- Valg af tidspunkt: Vælg et bestemt tidspunkt i dataene for at analysere outputtet fra de valgte celler, f.eks. ved t = 0 ms under diastol eller ved t = 200 ms under systole.
- Tidspause: Frys den dynamiske model for at fokusere på de markerede celler og deres output.
- Kontrast: Modulere kontrasten mellem de markerede celler og de omgivende celler i modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den nuværende protokol består af tre hovedtrin: zebrafiskforberedelse og mikroinjektion, lysarkbilleddannelse og 4D-billedrekonstruktion samt cellesporing og VR-interaktion. Voksne zebrafisk fik lov til at parre sig, de befrugtede æg blev indsamlet og udført mikroinjektion efter behov til de foreslåede forsøg (figur 1). Dette trin giver et indgangspunkt til at udforske zebrafiskapplikationer i undersøgelsen af hjerteudvikling og regenerering, og det spiller også en afgørende rolle i den efterfølgende billeddannelse og analyse. Det kontraherende hjerte blev afbildet på forskellige stadier (fra 3 dpf til 7 dpf) ved hjælp af det specialbyggede LSM-system og justerede billedsekvenserne langs z-aksen for at rekonstruere 4D-zebrafiskhjertemodellen (figur 2 og figur 3). Disse modeller danner grundlag for dybe fænotypiske karakteriseringer og er afgørende for at afsløre dynamikken i hjertemorfologien og funktionen på tværs af udviklingstidslinjer. De enkelte celler i zebrafiskens hjerte blev sporet, og deres bevægelse og interaktion blev kvantificeret ved hjælp af den tilpassede VR-platform. Hastigheden og de relative afstandsændringer for udvalgte celler blev også sammenlignet under en hjertecyklus i atrium og ventrikel for at vurdere regional kontraktilitet og undersøge lokal stamme (figur 4). Den regionale stamme blev bestemt ud fra variationen i forskydning mellem to tilstødende myokardceller i interesseområdet. Den fraktionelle forkortelse (FS) og uddrivningsfraktionen (EF) blev estimeret ved hjælp af metoder beskrevet i den offentliggjorte litteratur25. Ligningerne for FS og EF er som følger:
hvor Dd og Ds er ventrikeldiametrene (kort akse, målt ved afstande mellem forskellige ventrikelceller) i henholdsvis endediastoliske og endesystoliske stadier, og Vd og Vs er ventrikulære volumener (beregnet ved ventrikels lange og korte aksediametre) i henholdsvis endediastoliske og endesystoliske stadier.
Samlet set viser disse resultater en ny strategi, der integrerer både fysiologi og teknik for at lette volumetrisk billeddannelse og datafortolkning i zebrafiskmodeller, hvilket giver et stort løfte om at fremme udforskningen af hjertemorfogenese og mekanik.
Figur 1: Zebrafisk ægopsamling og mikroinjektionsproces. Processen involverer parring af voksne zebrafisk, indsamling af befrugtede æg og udførelse af den valgfri mikroinjektion. Under mikroinjektion fyldes den fortrukne glaspipette med de ønskede materialer. Befrugtede æg justeres i lige rækker inden for agaroseskimmelspalter og placeres vinkelret på nålen. Mikroinjektionen udføres under konstant mikroskopisk observation af både æggene og nålespidsen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Lysbilleddannelsesproces og 4D-billedrekonstruktion. (A) Skematisk oversigt over strukturen i det interne lysbilleddannelsessystem. CL: cylindrisk linse. EO: excitationsmål. DO: detektionsmål. TL: rør linse. FL: filter. CAM: sCMOS kamera. (B) Skematisk oversigt over en zebrafisk monteret i FEP-røret og indlejret af agarose. (C) Rå 2D-billedsekvens optaget fra en 4 dpf zebrafisklarve. Uret øverst til venstre på hvert billede angiver hjertefasen, der starter fra end-systole. (D) Illustration af retrospektiv synkronisering til 4D zebrafisk billedregistrering. Billedsekvens angiver en kontinuerlig optagelse i en bestemt dybde langs z-aksen. Hver ramme i billedsekvensen er repræsenteret af en rød prik, og start- og slutfaserne fra slutdiastol til slutsystol fremhæves i den gule boks. (E) 4D-rekonstruerede hjertemodeller fra 2D-billedsekvenserne. Dpf: dage efter befrugtning. Denne figur er tilpasset fra Zhang et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: LabVIEW-kontrolpanel. (A) De indstillinger, der bruges i kontrolpanelet, omfatter konfigurationen af laseren, kameraet, billedstien og motormønsteret. (B) Et eksempel på et billede af et rå zebrafiskhjerte taget af LabVIEW-programmet. Skalabjælke: 30 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Cellesporing og VR-interaktion hjælper med at afsløre zebrafiskens hjertekontraktilitet. (A) Sporede celler af Tg(myl7:nucGFP) zebrafiskhjerte ved 3 dpf. (B) VR-platformen giver brugerne en fordybende visning og interaktiv oplevelse af en 4D-zebrafiskhjertemodel, så man kan visualisere hjertefunktionen over tid gennem brugerdefineret analyse. (C) Efter indsamling af målinger fra VR-platformen blev hastigheds- og relative afstandsændringer sammenlignet i løbet af en hjertecyklus mellem udvalgte celler ved 3 dpf og 7 dpf. De to første figurer viser de gennemsnitlige hastighedsændringer i fem ventrikulære celler og fem atriale celler, og de andre illustrerer de relative afstandsændringer mellem tre grupper af celler, dvs. to ventrikulære celler, en ventrikulær celle og en atriecelle og to atriale celler. (D) Hjertefunktionsvurderinger af 3 dpf og 7 dpf zebrafiskhjerter. I alt 370 celler blev sporet i zebrafiskhjerter ved 3 dpf, og 580 celler blev sporet ved 7 dpf. Denne figur er tilpasset fra Zhang et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.
| NAVN | BRUG | IDENTIFIKATOR | |
| Tilpassede programmer og algoritmer | |||
| PSF.m | At beregne PSF ud fra FWHM-målinger af fluorescensperler. | MATLAB-programmet | |
| 4D zebrafisk Imaging.vi | At styre og synkronisere hardwaren i LSM-systemet. | LabVIEW-programmet | |
| test_Parallel.m osv. | At rekonstruere 4D-billeder fra 2D-billedsekvenser. | MATLAB-programmet | |
| imageDimConverter.m | At skjule billeddata til et bestemt format til cellesporing. | MATLAB-programmet | |
| separateTrackingResults.py | Sådan bogfører du procescellesporingsresultater for at adskille celler med samme etiketter. | Python-program | |
| cellTracking_All.py | At markere celler med ensartet billedintensitet på tværs af alle diskenheder. | Python-program | |
| cellLabelsToObj.ipynb | At generere et overfladenet for hver enkelt celle via 3D-udsnit. | Python-program | |
| DynamicHeartModel.cs osv. | At skabe et VR-miljø og interagere med objekter. | C# program | |
| Tilpasset hardwaredesign | |||
| 3D-printet prøvekammer | Til brug med vandnedsænkningsmål. | SolidWorks design | |
| 3D-printet prøveholder | Tilpasning til prøvefasen og opbevaring af prøven. | SolidWorks design | |
Tabel 1: Tabel over tilpassede ressourcer. Eksempelkoderne og dataene uploades til Zenodo21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Integrationen af zebrafiskmodellen med tekniske metoder rummer et enormt potentiale for in vivo-udforskning af myokardieinfarkt, arytmi og medfødte hjertefejl. Ved at udnytte sin optiske gennemsigtighed, regenerative kapacitet og genetiske og fysiologiske ligheder med mennesker er zebrafiskembryoner og larver blevet meget brugt i forskning 1,2,4. Den overlegne rumlige tidsmæssige opløsning, minimale fotoskader og optiske sektionsfunktioner ved lysarkbilleddannelse adskiller den til 4D-undersøgelse af hjertemorfologi og kontraktil funktion hos zebrafisklarver 12,26,27,28. Denne protokol introducerer en omfattende tilgang, der integrerer lysarkbilleddannelse, retrospektiv synkronisering, 3D-cellesporing og en interaktiv virtual reality (VR) platform til kvantitative vurderinger. Det giver et indgangspunkt til at fange og rekonstruere hjertekontraktion, spore og kvantificere den cellulære dynamik og vurdere de strukturelle, funktionelle og mekaniske ændringer under hjerteudvikling og regenerering. Denne metode kunne også styrkes ved flerkanals fluorescensbilleddannelse til at spore forskellige celletyper og slægter til undersøgelse af cellulær heterogenitet og intercellulær interaktion. Mens zebrafiskmodellens dikotomi fra pattedyrssystemer og dens begrænsning som en akut model berettiger nøje overvejelse, kan fremskridt inden for genteknologi give mulighed for udvikling af transgene zebrafisklinjer, der mere ligner menneskelige sygdomstilstande, og derved øge translationsværdien af resultater afledt af zebrafiskundersøgelser29.
Denne retrospektive synkronisering baseret på antagelsen om periodisk hjertecyklus bruges til at rekonstruere lysarkbillederne af det sammentrækkende zebrafiskhjerte. Implementeringen af denne metode i lysarkbilleddannelse gør det muligt at visualisere og analysere det kontraherende hjerte med over 200 volumener pr. Sekund. For at løse udfordringen med den store mængde data i den aktuelle analyse blev parallel beregning med multi-core CPU og GPU brugt, hvilket resulterede i mere end ti gange forbedring i billedrekonstruktionseffektiviteten. Under den retrospektive synkronisering blev det forudsat, at kardiomyocytterne vender tilbage til deres baseline-positioner med hvert hjerteslag. Selvom denne antagelse er relativt sikker i betragtning af den lave variation i hjerteslag, der ses hos zebrafisk26 som vist i figur 4C, forbliver det en forenkling, der muligvis ikke tager højde for alle biologiske nuancer. Innovationer inden for billeddannelse, såsom kompressionsfluorescens og lysfeltmikroskopi, kan afbøde virkningerne af denne antagelse ved at reducere skiveredundans.
For at muliggøre den dybdegående analyse i den indviklede 4D-hjertemodel blev der udviklet en beregningsramme, der omfattede både 3DeeCellTracker-baseret cellesegmentering og VR-platform til brugerrettede undersøgelser. De iboende evner i denne ramme, herunder den høje effektivitet og interaktive manipulation, gør det muligt at kvantificere den cellulære hastighedsændring, undersøge celle-celle-interaktionerne og vurdere den regionale og globale myokardiemekanik såsom fraktioneret forkortelse, udstødningsfraktion og regional stamme30 (figur 4). Fraværet af forudgående vurderinger af zebrafiskens hjertefunktion ved 7 dpf i den eksisterende litteratur bemærkes. Men sammenlignet med data ved 3 dpf leveret af andre forskere er de nuværende resultater i overensstemmelse med tidligere indikationer på et fald i både udstødningsfraktion (EF) og fraktioneret forkortelse (FS) i intervallet fra 3 dpf til 7 dpf25,31. Disse analysemetoder har et betydeligt potentiale for at belyse hjertedynamik i zebrafiskens hjerteskademodeller12,25.
Da VR-teknologi og software indeholder unikke funktioner såsom stereoskopisk syn og automatisk registrering af cellepositioner, giver denne platform mulighed for en fordybende og strømlinet metode til at vælge specifikke celler og analysere deres bane gennem hele hjertecyklussen. Brugen af VR giver en intuitiv måde at udføre komplekse opgaver såsom cellesegmentering og annotering med større effektivitet og nøjagtighed 32,33,34. Det understøtter også flere brugere til at bruge unikke værktøjer, når de arbejder sammen om store, komplicerede datasæt34. Selvom langvarig brug af VR kan fremkalde bivirkninger som svimmelhed, kan dette afbødes ved forbedret ergonomisk design og løsgående headset. For at imødekomme den betydelige beregningskraft, der kræves for at gengive komplekse biologiske strukturer i realtid, kan optimering af software til øjeblikkelig behandling og udnyttelse af skybaserede computerløsninger desuden forbedre systemets evne til at styre indviklede visualiseringer.
Med hardwareenheder og beregningskraft fortsætter med at udvikle sig, kan denne strategi udvides til at undersøge hjertearytmier i myokardiet på både cellulære og vævsniveauer, hvilket i sidste ende har potentialet til at optrævle den underliggende mekanisme for hjertemorfogenese og fremme udviklingen af terapeutiske interventioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt at oplyse.
Acknowledgments
Vi udtrykker vores taknemmelighed over for Dr. Caroline Burns på Boston Children's Hospital for generøst at dele den transgene zebrafisk. Vi takker fru Elizabeth Ibanez for hendes hjælp med at opdrætte zebrafisk på UT Dallas. Vi sætter også pris på alle de konstruktive kommentarer fra D-inkubatormedlemmer på UT Dallas. Dette arbejde blev støttet af NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) og UT Dallas STARS-programmet (Y.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
| Animal models | |||
| Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish | Burns Lab in Boston Children's Hospital | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| Software and algorithms | |||
| MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
| Unity | Unity Software Inc. | 2020.3.2f1 | |
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| 3D Slicer | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 | |
| Light-sheet system | |||
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| 4X Illumination objective | Nikon | MRH00045 | |
| 20X Detection objective | Olympus | 1-U2M585 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Motorized XYZ stage | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
| Two-axis tilt stage | Thorlabs | GN2/M | |
| Rotation stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow | R471003GX | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow | R531003FX | |
| Microinjector and vacuum pump | |||
| Microinjector | WPI | PV850 | |
| Vacuum pump | Welch | 2522B-01 | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | |
| Capillary tip for gel loading | Bio-Rad | 2239912 | |
| Virtual reality hardware | |||
| VR headset | Meta | Quest 2 | |
| 30mg/L PTU solution | |||
| PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 1X E3 working solution | - | - | |
| 1% Agarose | - | - | |
| Low-melt agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | - | - | |
| 10g/L Tricaine stock solution | |||
| Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
| Deionized water | - | - | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 150mg/L Tricaine working solution | |||
| 10g/L Tricaine stock solution | - | - | |
| Deionized water | - | - | |
| 60X E3 stock solution | |||
| Sodium Chloride | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | NaCl | |
| Potassium Chloride | - | KCL | |
| Calcium Chloride Dihydrate | - | CaCL2 x 2H2O | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | - | MgSO4 x 7H2O | |
| RO Water | - | - | |
| 1X E3 working solution | |||
| 60X E3 stock solution | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | - | |
| RO Water | - | - | |
| 1% Methylene Blue (optional) | - | C16H18ClN3S |
References
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ. Res. 110 (6), 870 (2012).
- Ding, Y., Bu, H., Xu, X. Modeling inherited cardiomyopathies in adult zebrafish for precision medicine. Front. Physiol. 11, 599244 (2020).
- Giardoglou, P., Beis, D. On zebrafish disease models and matters of the heart. Biomedicines. 7 (1), 15 (2019).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational analysis of cardiac contractile function. Curr. Cardiol. Rep. 24 (12), 1983-1994 (2022).
- Weber, M., Huisken, J. In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy. Swiss Med. Wkly. 145 (51), w14227 (2015).
- Vedula, V., et al. A method to quantify mechanobiologic forces during zebrafish cardiac development using 4-D light sheet imaging and computational modeling. PLOS Comput. Biol. 13 (10), e1005828 (2017).
- Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos. Dev. Dyn. 246 (11), 868-880 (2017).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog. Biophys. Mol. Biol. 138, 105-115 (2018).
- Salman, H. E., Yalcin, H. C. Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling. Micron. 130, 102801 (2020).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J. Biophotonics. 16 (5), e202200278 (2023).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7 (2), 026112 (2023).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. Eugene. , University of Oregon Press. (2000).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. 25, e1115 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T.
- Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart. J Vis Exp. 138, e57763 (2018).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in Zebrafish larvae. Zenodo. , (2023).
- Wen, C., et al. 3deecelltracker, a deep learning-based pipeline for segmenting and tracking cells in 3d time lapse images. Elife. 10, e59187 (2021).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Fedorov, A., et al. 3D Slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magn. Reson. Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
- Naderi, A. M., et al. Deep learning-based framework for cardiac function assessment in embryonic zebrafish from heart beating videos. Comput. Biol. Med. 135, 104565 (2021).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat. Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J. Clin. Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3 (16), e121396 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab. Anim. Res. 37 (1), 1-29 (2021).
- Coelho-Filho, O. R., et al. Quantification of cardiomyocyte hypertrophy by cardiac magnetic resonance: implications on early cardiac remodeling. Circulation. 128 (11), 1225 (2013).
- Zhang, B., et al. Automatic segmentation and cardiac mechanics analysis of evolving zebrafish using deep learning. Front. Cardiovasc. Med. 8, 675291 (2021).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), e97180 (2017).
- Koger, C. R., Hassan, S. S., Yuan, J., Ding, Y. Virtual reality for interactive medical analysis. Front. Virtual Real. 3, 782854 (2022).
- Yuan, J., et al.
