Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Anvendelse av Ha-CoV-2 pseudovirus for rask kvantifisering av SARS-CoV-2-varianter og nøytraliserende antistoffer

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65793
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Infectious Disease Research, School of Systems Biology, George Mason University

Summary

Denne protokollen beskriver anvendelsen av et nytt hybrid alfavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) som en plattform for rask kvantifisering av smittsomhet av SARS-CoV-2-varianter og deres følsomhet for nøytraliserende antistoffer.

Abstract

Koronavirussykdommen 2019-pandemien (COVID-19) har fremhevet behovet for raske analyser for nøyaktig å måle smittsomheten til nye SARS-CoV-2-varianter og effektiviteten av vaksineinduserte nøytraliserende antistoffer mot virusvarianter. Disse analysene er avgjørende for pandemiovervåking og validering av vaksiner og variantspesifikke boostere. Dette manuskriptet demonstrerer anvendelsen av et nytt hybrid alfavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) for rask kvantifisering av SARS-CoV-2-variantens smittsomhet og vaksineinduserte nøytraliserende antistoffer mot virusvarianter. Ha-CoV-2 er en SARS-CoV-2 viruslignende partikkel som består av virale strukturelle proteiner (S, M, N og E) og et raskt uttrykkende RNA-genom avledet fra et alfavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 inneholder også både grønt fluorescerende protein (GFP) og luciferase reportergener som muliggjør rask kvantifisering av viral smittsomhet. Som et eksempel kvantifiseres smittsomheten til variantene SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) og Omicron (B.1.1.529), og deres følsomhet for et nøytraliserende antistoff (27VB) måles også. Disse eksemplene demonstrerer det store potensialet for Ha-CoV-2 som en robust plattform for rask kvantifisering av SARS-CoV-2-varianter og deres følsomhet for nøytraliserende antistoffer.

Introduction

Per mai 2023 har det nå vært mer enn 766 millioner covid-19-tilfeller1. Til tross for verdensomspennende vaksinasjonskampanjer sirkulerer SARS-CoV-2 kontinuerlig og infiserer mennesker, hovedsakelig på grunn av fremveksten av nye varianter som Delta (B.1.617.2) og Omicron (B.1.1.529) som driver nye infeksjonsbølger 2,3,4. Gitt at SARS-CoV-2 er i kontinuerlig utvikling er det viktig å utvikle raske analyser som nøyaktig kan måle smittsomheten til nye varianter og effektiviteten av vaksineinduserte nøytraliserende antistoffer mot disse variantene. Disse analysene er avgjørende for pandemiovervåking og for å bestemme effekten av vaksiner og deres variantspesifikke boostere.

På grunn av SARS-CoV-2s svært smittsomme karakter krever Center for Disease Control and Prevention (CDC) at studien av SARS-CoV-2 og dens varianter utføres i biosikkerhetsnivå (BSL) 3 fasiliteter 5,6. Dette BSL-3-kravet begrenser bruken av levende virus for å kvantifisere smittsomheten til virusvarianter og deres nøytraliserende antistoffer i felles forskning og kliniske laboratorier. I tillegg er tradisjonelle SARS-CoV-2 nøytraliseringsanalyser, som plakk- eller cytopatiske effektbaserte analyser ved bruk av replikasjonskompetente levende virus, tidkrevende og krever lange inkubasjonsperioder7. Flere spike (S) protein-pseudotype SARS-CoV-2 pseudovirus har blitt utviklet for å kvantifisere effektiviteten av nøytraliserende antistoffer 8,9,10,11,12. I SARS-CoV-2 er S-proteinet det viktigste proteinet som medierer viral inngang13, og er hovedantigenet som brukes i SARS-CoV-2-vaksiner 9,10,14,15,16. S-protein-pseudotypede virioner, slik som vesikulært stomatittvirus (VSV-G) eller lentivirus, har blitt brukt til kvantifisering av nøytraliserende antistoffer 17,18,19. Likevel krever det lentivirusbaserte pseudoviruset normalt 2 til 3 dagers infeksjon for å kvantifisere reportersignaler. VSV-baserte pseudovirussystemer inneholder ofte gjenværende VSV-virus, noe som kan resultere i høye forekomster av falske positive resultater og krever vanligvis 24 timers infeksjon20.

Et nytt SARS-CoV-2 pseudovirussystem, hybrid-alfavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2), har nylig blitt utviklet av Hetrick et al12. Ha-CoV-2 gir et nytt verktøy for rask kvantifisering av virussmittsomhet og virusfølsomhet for nøytraliserende antistoffer i vanlige BSL-2-laboratorier. Strukturelt ligner Ha-CoV-2 SARS-CoV-2-virionpartikkelen, som består av SARS-CoV-2 strukturelle proteiner inkludert S-proteinet (S), membranen (M), nukleokapsidet (N) og konvolutten (E), og det er ikke noe strukturelt protein fra andre virus. I tillegg inneholder Ha-CoV-2-partikkel et hurtiguttrykkende RNA-genom fra et alfavirus for rask reporterekspresjon i celler. Ha- CoV-2 har vist seg å raskt måle den nøytraliserende aktiviteten til antistoffer i sera hos vaksinerte og rekonvaleserende individer12. Som demonstrert av Hetrick et al., sammenlignet med lentivirusbasert SARS-CoV-2 pseudovirus i en tidsløpsanalyse, uttrykte Ha-CoV-2 Luc-reporteren så tidlig som 2-4 timer etter infeksjon mens lentivirus-pseudoviruset uttrykte Luc etter 24 timer12. I tillegg er den potensielle anvendelsen av Ha-CoV-2-varianter for kvantifisering av nøytraliserende antistoffer ytterligere demonstrert ved bruk av et standard monoklonalt nøytraliserende antistoff, 27BV (se tilleggsfigur 1)12. Dette arbeidet beskriver anvendelsen av Ha-CoV-2-plattformen for rask kvantifisering av smittsomheten til SARS-CoV-2-varianter, med utgangspunkt i variantene Delta (B.1.617.2) og Omicron (B.1.1.529). I tillegg er den potensielle anvendelsen av Ha-CoV-2-varianter for kvantifisering av nøytraliserende antistoffer ytterligere demonstrert ved bruk av et standard monoklonalt nøytraliserende antistoff, 27BV12.

Protocol

1. Virus og viral partikkelmontering

  1. Vektorer: Kjøp uttrykksvektorer for SARS-CoV-2 M, E eller N så vel som SARS-CoV-2 S (Wild-type, Wt), Delta (B.1.617.2) og Omicron (B.1.1.529) kommersielt.
    MERK: Proteinsekvenser av ekspresjonsvektorene er gitt i tilleggsfil 1. Leverandøren av disse uttrykksvektorene finner du også under materialfortegnelsen.
  2. Celler og cellekultur: Opprettholde HEK293T celler i Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) som inneholder 10% varmeinaktivert føtal bovint serum (FBS), 50 enheter / ml penicillin og 50 μg / ml streptomycin.
    MERK: Alt cellekulturarbeid må gjøres i et biosikkerhetsskap for laminær luftstrøm. Polyetylenimin (PEI) transfeksjon krever vanligvis 5-6 h inkubasjon. Starttider må vurderes nøye på forhånd.
  3. Virusmontering og PEI-basert kotransfeksjon: Sett sammen Ha-CoV-2-partikler ved kotransfeksjon av HEK293T celler. Frøceller i en 10 cm cellekultur petriskål (4-5 x 106 celler per tallerken) i 10 ml komplett DMEM medium dagen før kotransfeksjon. For denne studien brukes tre petriskåler til frøceller for montering av henholdsvis Ha-CoV-2 villtype, delta og omikron.
  4. Inkuber petriskåler over natten i en CO2 -inkubator ved 37 ° C. Sjekk oppvasken neste morgen for å sikre at cellene er 80% sammenflytende. Fjern hele mediet og erstatt det med 9 ml DMEM serumfrie medier.
  5. For hver tallerken, lag en kotransfeksjonsblanding med 2,5 μg av hver av SARS-CoV-2 strukturelle proteinuttrykksvektorer (N, E, M), 10 μg pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (HaCoV2-genom) og 2,5 μg av S-proteinuttrykksvektoren, enten Delta- eller Omicron S-variantene og 45 μL PEI-basert transfeksjonsreagens. La kotransfeksjonsblandingen danne komplekser ved å inkubere i 13 minutter (ikke inkuber i mer enn 30 minutter).
  6. Etter inkubering, tilsett kotransfeksjonsblandingen til hver petriskål sakte, dråpevis. Legg oppvasken inne i en CO2 -inkubator ved 37 ° C i 6 timer. Etter 6 timer, fjern serumfri DMEM og erstatt den med komplett DMEM-medium. Høstvirus ved 48-60 timer etter kotransfeksjon.
  7. Virushøsting og lagring: Høstpartikler ved 48 timer etter kotransfeksjon. Løsne celler ved å pipettere gjentatte ganger over overflaten av monolaget og samle celler fra hver tallerken, sett inn i 15 ml sentrifugerør og sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter. Samle supernatanten og pass den gjennom et 0,22 μM filter. Oppbevar pseudoviruset Ha-CoV-2 ved -80 °C.

2. Viral smittsomhetsanalyse

  1. Celler og cellekultur: Opprettholde HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler i Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) som inneholder 10% varmeinaktivert FBS, 50 enheter / ml penicillin og 50 μg / ml streptomycin.
  2. Såing HEK293T(ACE2/TMPRSS2) celler: Dagen før viral infeksitivitetsanalyse, frø HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler i en 96-brønnplate i 50 μL komplett DMEM media. For hver 96-brønns plate frø 2,5 x 104 celler inn i hver brønn, og totalt 2,5 x 106 celler er nødvendig for en plate. Plasser 96-brønnplaten i en CO2 -inkubator ved 37 °C over natten.
  3. Infeksjon av HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Bruk partikler av Ha-CoV-2-varianter til å infisere HEK293T(ACE2/TMPRSS2) celler. På morgenen av infeksjon, fjern 50 μL DMEM fra pre-seeded 96 brønnplate. Bytt ut medier med 50 μL av enten Ha-CoV-2 Wild-type, Delta eller Omicron i 18 timer ved 37 °C.
    MERK: Protokollen kan stoppes her til infeksjonen har nådd 18 timers inkubasjon og platen er klar til å bli analysert via Luciferase Assay. Infeksjonens suksess bestemmes av Luciferase-analysen som følge av Luciferase-reportergenet uttrykt i de infiserte cellene, derfor jo mer signal produseres, desto mer vellykket er infeksjonen av Ha-CoV-2-varianten.
  4. Luciferase-analyse: Etter 18 timers inkubasjon, tilsett 7,5 μL cellelysebuffer direkte til hver brønn og bland ved orbital risting i 2 minutter. Lyse celler i lysisbuffer i minst 5 min ved romtemperatur.
  5. Forbered Firefly luciferase-analyseløsningen ved å blande D-luciferin-løsningen med Firefly luciferase-analyseløsningen i forholdet 1:50. For en hel 96-brønnsplate, kombiner 3 ml av luciferase-substratoppløsningen med 60 μL D-luciferin-løsningen med 2940 μL av Firefly luciferase-bufferløsningen.
  6. Tilsett 25 μL av Firefly luciferase-analyseløsningen til cellelysatene og bland platen ved orbital risting i 1 min. Analyser luciferase-aktiviteten ved hjelp av en kommersiell luciferase mikroplateleser.

3. RNA-ekstraksjon av Ha-CoV-2 og kvantitativ revers transkriptase-PCR (RT-qPCR)

  1. Viral RNA-ekstraksjon: Trekk ut viralt RNA fra Ha-CoV-2 Wild-type og Ha-CoV-2 Delta- og Omicron-variantpartikler ved hjelp av et kommersielt viralt RNA-ekstraksjonssett, i henhold til produsentens instruksjoner. Oppbevar det ekstraherte virale RNA ved -80 °C eller bruk det umiddelbart til RT-qPCR.
  2. RT-qPCR: Utfør RT-qPCR på viralt RNA ved hjelp av en ett-trinns mastermiks. Utfør reaksjonen i en kommersiell PCR-maskin. Vær oppmerksom på at målet for amplifisering er det genomiske RNA av Ha-CoV-2. Bruk Ha-CoV-2 vektor DNA som en standard for å lage en standardkurve og beregne RNA-kopinummeret til hver variant.

4. Nøytraliserende antistoffanalyse

  1. Såing HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler: Dagen før analysen, frø HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler i en 96 brønnplate i 50 μL komplett DMEM media. HEK293T(ACE2/TMPRSS2) celler kjøpes kommersielt.
  2. For telling av celler, oppnå 20 μL-celler fra en T75-kolbe som inneholder HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler, og bland med 20 μL trypanblå løsning. Tilsett 20 μL av denne blandingen til celletellekammeret og tell antall celler per ml. For å så en 96 brønnplate for infeksjon, bruk 2,5 x 104 celler per brønn, og 2,5 x 106 celler vil være nødvendig totalt. Plasser 96 brønnplate i en CO2 -inkubator ved 37 °C over natten.
  3. Nøytraliserende antistoffanalyse: I en steril polypropylen 96-brønnplate, lag standard 27BV nøytraliserende antistoff og Ha-CoV-2-blanding. Tilsett 8 μL 27BV (45 mg/ml) til platen og utfør serielle fortynninger av antistoffet med 6 μL serumfri DMEM.
    MERK: Sørg for å bytte pipettespisser mellom brønnoverføringer og sørg for at antistoffet og serumfritt medium blandes grundig for å gi nøyaktige resultater.
  4. Til det serielt fortynnede antistoffet, tilsett 54 μL Ha-CoV-2-partikkel og bland viruset og antistoffet. Pre-inkubere Ha-CoV-2 partikler med serielt fortynnet 27BV i 1 time ved 37 °C ved 5% CO2. Etter 1 h-inkubasjonen, påfør 50 μL av antistoffet og Ha-CoV-2-blandingen på 96-brønnsplaten som inneholder HEK293T(ACE2/TMPRSS2) cellene (2,5 x 104 celler per brønn) sådd dagen før.
  5. For kontroller, la minst tre brønner inneholde bare HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler. Tilsett 50 μL komplett medium til disse brønnene for å tjene som ikke-infiserte brønner for bakgrunnssignal for luciferase-analyseavlesningene.
    MERK: Protokollen kan stoppes her til infeksjonen har nådd 18 timers inkubasjon ved 37 °C, og deretter er platen klar til å analyseres via luciferaseanalyse.
  6. Luciferase-analyse: Etter 18 timers inkubasjon, tilsett 7,5 μL lysisbuffer direkte til hver brønn og bland ved orbital risting i 2 minutter. Lyse celler i lysisbuffer i minst 5 min ved romtemperatur.
  7. Forbered Firefly luciferase-analyseløsningen ved å blande D-luciferin-løsningen med Firefly luciferase-analyseløsningen i forholdet 1:50. For en hel 96-brønnsplate, kombiner 3 ml av luciferase-substratoppløsningen med 60 μL D-luciferin-løsningen med 2940 μL av firefly luciferase-bufferløsningen.
  8. Tilsett 25 μL av Firefly luciferase-analyseløsningen til cellelysatene og bland platen ved orbital risting i 1 min. Analyser luciferase-aktiviteten ved hjelp av en kommersiell luciferase mikroplateleser.

5. Kvantifisering og statistisk analyse

  1. Datainnsamling: Utfør infeksjons- og luciferaseanalyser i triplikat som indisert (figur 1). Kvantifiser luciferase-uttrykk med luciferase-analyseavlesninger. Gjennomsnittet er gjennomsnittsverdien av de tre luciferase-analyseavlesningene. Bakgrunnssignalavlesninger fra ikke-infiserte brønner trekkes fra denne middelverdien. Standardavvik (SD) bestemmes ut fra gjennomsnittsverdien av luciferaseanalyseavlesningene.
  2. Dataanalyse: Plott antistoffnøytraliseringsaktivitet og beregne ID50 (50% inhiberingsdosering) verdier ved hjelp av kommersiell grafisk programvare. ID50-verdien er definert som antistoffhemmende fortynninger der en 50 % reduksjon i infeksjonen av HEK293T(ACE2/TMPRSS2) celler (basert på luciferaseanalyseavlesninger) oppnås.

Representative Results

Ha-CoV-2-partikler ble satt sammen ved hjelp av fem forskjellige DNA-vektorer som uttrykker Ha-CoV-2 RNA-genomet og strukturelle proteiner (M, N, E og S) av SARS-CoV-2 i HEK293T celler. S-proteinvektoren varierer avhengig av S-varianten. S-proteinet fra den opprinnelige Ha-CoV-2 Wuhan-stammen (Wild-type, Wt) ble brukt som en positiv kontroll, og det ble samlet sammen med S-proteinet fra hver av de to andre variantene: Delta (B.1.617.2) eller Omicron (B.1.1.529). De samme M, N, E ble brukt i alle varianter. Ha-CoV-2(Wt) og variantpartikler ble samlet 48 timer etter kotransfeksjon og deretter brukt til å infisere HEK293T(ACE2/TMPRSS2) celler. Smittsomhet ble målt ved ekspresjon av luciferase 18 timer etter infeksjon. I dette systemet reflekterer høyere ekspresjonsnivåer av luciferase-signal en høyere infeksjon av celler av Ha-CoV-2. Luciferase-signalet ble normalisert med genomiske RNA-kopier av RT-qPCR for hver variant. Som vist i figur 1 genererte Ha-CoV-2 Omicron-varianten 4 til 10 ganger høyere signal enn den opprinnelige Ha-CoV-2 (Wt), noe som tyder på en høyere smittsomhet.

Videre ble kapasiteten til 27BV for å nøytralisere HaCoV-2 (Wt), Delta og Omicron-varianter kvantifisert. 27BV er et kaninmonoklonalt antistoff som ble utviklet mot RBD-domenet til SARS-COV-2 S1-proteinet. For nøytraliseringsanalyser ble serielle fortynninger av 27BV utført i en 96-brønnsplate, pre-inkubert med Ha-CoV-2, og deretter tilsatt HEK293T(ACE2/TMPRSS2) målceller. Resultatene viste at 27BV hadde nøytraliserende aktivitet mot alle de testede variantene (figur 2). Interessant nok var ID50 på 27VB for Omicron omtrent 10 ganger mindre potent enn ID50 for Ha-CoV-2(WT) og Ha-CoV-2(Delta; Figur 2). Disse resultatene viser at Ha-COV-2-plattformen kan brukes som en rask metode for å kvantifisere vaksineinduserte nøytraliserende antistoffer i nye varianter.

Figure 1
Figur 1. Montering og kvantifisering av Ha-CoV-2 varianter. (A) Illustrasjon av montering av Ha-CoV-2 og variantpartikler. Vektorene som uttrykker Ha-CoV-2 reportergenomet og strukturelle proteiner (M, S, N og E) er kotransfektet i HEK293T celler. Partikler ble høstet 48 timer etter kotransfeksjon (avbildning av virionpartikkel og HEK293T celler ble opprettet med Biorender.com). (B) Kvantifisering av smittsomheten til Ha-CoV-2-varianter. Den relative smittsomheten til de to variantene (delta og omikron) kvantifiseres og normaliseres ved bruk av genomiske RNA-kopier av individuelle Ha-CoV-2 (Luc)-varianter. Wild-type er Ha-COV-2 (Wt), som brukes som en kontroll for sammenligning. Infeksjons- og luciferaseanalyser ble utført 3x. RU, relativ enhet. Gjennomsnittet og standardavviket (SD) vises. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Kvantifisering av 27BV nøytraliseringsaktivitet mot Ha-CoV-2 (Luc) varianter Nøytraliseringsaktivitet av 27BV ble analysert 18 timer etter infeksjon av HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) celler. ID50 ble beregnet ved hjelp av relativ infeksjonsrate (luciferaseaktivitet) versus 27BV-konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Infeksjon av HEK293T(ACE2/TMPRSS2) med Ha-CoV-2(GFP). Ha-CoV-2 (GFP) partikler ble satt sammen og deretter brukt til å infisere HEK293T(ACE2/TMPRSS2) celler. GFP-ekspresjon ble observert 48 timer etter infeksjon ved bruk av fluorescerende mikroskopi. Det hvite feltet av infiserte celler vises til venstre, og GFP-avbildning vises til høyre. Den hvite linjen representerer 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1. Grafisk abstrakt. Ha-CoV-2 pseudovirus struktur og anvendelse. Bilde opprettet med Biorender.com. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1. Proteinsekvenser. Liste over sekvensene av SARS-CoV-2 S-, M-, N- og E-proteiner. S-proteinsekvensene inkluderer også SARS-CoV-2-variantene omikron (B.1.1.529) og delta (B.1.617.2). Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Ha-CoV-2-plattformen gir en rask, robust og enkel arbeidsflyt for å kvantifisere virusvarianter og nøytralisere antistoffer. Det er imidlertid noen kritiske trinn som trenger oppmerksomhet. Produksjonen av Ha-CoV-2 pseudovirus bør utføres ved hjelp av HEK293T celler med høy levedyktighet. Kotransfeksjonseffektiviteten kan overvåkes 24 timer etter transfeksjon ved bruk av GFP-reportergenet fra Ha-CoV-2-genomet. Ha-CoV-2-genomet kan inneholde to reportere (GFP og Luc), og GFP kan uttrykkes under kotransfeksjon og etter Ha-CoV-2-infeksjon av målceller12. GFP+-cellene fra infeksjon har normalt en lav prosentandel (1 % til 5 %), men hver infiserte celle uttrykker sterke GFP-signaler (figur 3). Denne lave GFP-prosentandelen kan begrense bruken av GFP som en robust avlesning for kvantifisering av antistoffnøytralisering, sammenlignet med Luc-reporteren, som kvantifiserer hele populasjonen av infiserte celler.

Når nøytraliseringsanalysen utføres, er det viktig å bytte pipettespisser mellom brønnoverføringer og for å sikre at antistoffet og serumfritt medium blandes grundig for å gi nøyaktige resultater. I tillegg, når du utfører luciferase-analyseprotokollen, må cellene være fullt lysert i minst 3 minutter for å sikre fullstendig lysering av celler og frigjøring av luciferase-enzymet. Dette vil sikre nøyaktigheten av analysen. I tillegg, når Firefly luciferase-analyseløsningen er tilsatt til de optiske hvitveggede 96-brønnplatene, må platen analyseres innen 10 minutter, da det første lysutslippet er høyt, men avtar over tid ettersom ATP er utarmet21.

Etter hvert som flere SARS-CoV-2-varianter fortsetter å utvikle seg, er det et økt behov for plattformer som Ha-CoV-2 for raskt å screene for variantsmittsomhet og variantfølsomhet for vaksineinduserte nøytraliserende antistoffer. Ha-CoV-2-plattformen tilbyr raskere hastighet, et høyere signal-støy-forhold og en enkel protokoll sammenlignet med eksisterende pseudovirusbaserte nøytraliseringsanalyser 8,9,10,11. Ha-CoV-2-plattformen har også den fordelen at den kan brukes i BSL-2-laboratorier og krever ikke bruk av BSL-3-anlegg. Dette gjør at SARS-CoV-2 til forskning kan forfølges i felles forskning og kliniske laboratorier. Videre gir Ha-CoV-2-plattformen raske resultater sammenlignet med andre systemer. For eksempel bruker studien av nøytraliserende antistoffer mot infeksiøst SARS-CoV-2-virus ofte plakkreduksjonsnøytraliseringstesten (PRINT)22. Selv om PRINT gir pålitelige resultater, er manuell telling av plakkdannende enheter (PFUer) langsom og krever 3-5 dager for å oppnå resultater23,24. Andre pseudotypesystemer, som lentivirus-pseudoviruset, trenger 24-72 timer for å produsere et detekterbart reportersignal12. Til sammenligning kan Ha-CoV-2-nøytraliseringsanalysen generere resultater innen 18 timer. Ha-CoV-2 gir et praktisk verktøy for rask screening og kvantifisering av virusvarianter og nøytraliserende antistoffer for pandemiovervåking.

Overvåking av smittsomheten til SARS-CoV-2 er viktig ettersom flere varianter av bekymring (VOC) fortsetter å dukke opp. Ha-CoV-2 gir fordelen av raskt å bestemme smittsomheten til VOC. Tidligere studier har anvendt kunstig intelligens (AI)-basert modellering for kvantitativt å analysere smittsomheten til omikron-undervarianten og de andre SARS-CoV-2-variantene, som for eksempel Delta-varianten25. Disse studiene har vist at omikronvarianten er mer smittsom enn det opprinnelige viruset, og mer sannsynlig å unnslippe nøytraliserende antistoffer25. I disse studiene, ved bruk av Ha-CoV-2, ble lignende fenotyper observert. I tillegg, i antistoffnøytraliseringsanalysene, er Omicron-varianten ti ganger mindre sannsynlig å bli nøytralisert med 27BV enn Wuhan- og Delta-stammene. Disse resultatene er også konsistente med den rapporterte høyere overførbarheten av Omicron-varianten, som har minst 15 mutasjoner på sitt reseptorbindingsdomene (RBD), som sannsynligvis øker virusbindingsaffiniteten til ACE2-reseptoren for høyere overførbarhet og større immunflukt26.

Disclosures

Et patent er innlevert av George Mason University og lisensiert til Virongy Biosciences Inc. for produktutvikling. YW er grunnlegger og medlem av det rådgivende styret i Virongy Biosciences. B. H er for tiden administrerende direktør og Chief Scientific Officer i Virongy Biosciences. Forfatterne har ingen andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av George Mason University interne forskningsfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
27VB1 20 µg SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody Virongy Biosciences 27VBI-01
500 mL - US Origin FBS Neuromics FBS001
AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit  Genesee Scientific Cat# 24-300 
Allegra 6R Centrifuge Beckman Coulter 2043-30-1158
DMEM (1x)  ThermoFisher  11995-073
GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit Genesee Scientfic 25-209
GlowMax Discover Microplate reader Promega  GM3000 
Ha-CoV-2 E Vector  Virongy Biosciences pCoV2_E
Ha-CoV-2 M Vector  Virongy Biosciences pCoV2_M
Ha-CoV-2 N Vector  Virongy Biosciences pCoV2_N
Ha-CoV-2 WT S Vector Virongy Biosciences pCoV2_WT S
Hek293T cells ATCC CRL-3214
Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays Gold Bio  I-930-1000
Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, μClear White Flat Round, Chimney)  VWR  Cat# 82050-758 
pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (Ha-CoV-2 Genome) Vector  In house
PEI-based Transfection Reagent Virongy Biosciences Transfectin
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) Invitrogen 10378016
Polyethylenimine, branched Millipore Sigma 408727-100ML
QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System ThermoFisher  A43163
Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells Virongy Biosciences Ready-To-Use-Cells
SARS-CoV-2 S  Omicron (B.1.1.529) Vector Virongy Biosciences pCoV2-B.1.1.529
SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2) Vector Virongy Biosciences pCoV2- B.1.617.2
Syringe Filters, PES, 0.22µm Genesee Scientfic 25-244
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix ThermoFisher  4444432
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher  15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Weekly epidemiological update on COVID-19. 143, 1 (2023).
  2. Dhama, K., et al. Global emerging Omicron variant of SARS-CoV-2: Impacts, challenges and strategies. Journal of Infection and Public Health. 16 (1), 4-14 (2023).
  3. Dhama, K., et al. Coronavirus Disease 2019-COVID-19. Clinical Microbiology Reviews. 33 (4), e00028-e00020 (2020).
  4. El-Shabasy, R. M., et al. Three waves changes, new variant strains, and vaccination effect against COVID-19 pandemic. International Journal of Biological Macromolecules. 204, 161-168 (2022).
  5. CDC. Interim laboratory biosafety guidelines for handling and processing specimens associated with coronavirus disease 2019 (COVID-19). , https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/lab-biosafety-guidelines.html (2021).
  6. Kaufer, A., Theis, T., Lau, K., Gray, J., Rawlinson, W. Laboratory biosafety measures involving SARS-CoV-2 and the classification as a Risk Group 3 biological agent. Pathology. 52 (7), 790-795 (2020).
  7. Vanderheiden, A., et al. Development of a Rapid Focus Reduction Neutralization Test Assay for Measuring SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies. Current Protocols in Immunology. 131 (1), e116 (2020).
  8. Dieterle, M. E., et al. A Replication-Competent Vesicular Stomatitis Virus for Studies of SARS-CoV-2 Spike-Mediated Cell Entry and Its Inhibition. Cell Host & Microbe. 28 (3), 486-496 (2020).
  9. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  10. Nie, J., et al. Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 680-686 (2020).
  11. Yang, R., et al. Development and effectiveness of pseudotyped SARS-CoV-2 system as determined by neutralizing efficiency and entry inhibition test in vitro. Biosafety and Health. 2 (4), 226-231 (2020).
  12. Hetrick, B., et al. Development of a hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirion for rapid quantification of neutralization antibodies and antiviral drugs. Cell reports methods. 2 (3), 100181 (2022).
  13. Jackson, C., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).
  14. Jackson, L. A., et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report. The New England Journal of Medicine. 383 (20), 1920-1931 (2020).
  15. Polack, F. P., et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. The New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  16. Li, F. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Annual Review of Virology. 3 (1), 237-261 (2016).
  17. Donofrio, G. A Simplified SARS-CoV-2 Pseudovirus Neutralization Assay. Vaccines. 9 (4), 389 (2021).
  18. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and Reagents for Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein for Neutralization Assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
  19. Zettl, F., et al. Rapid Quantification of SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies Using Propagation-Defective Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes. Vaccines. 8 (3), 386 (2020).
  20. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), e1963 (2018).
  21. Lundin, A. Optimization of the firefly luciferase reaction for analytical purposes. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 145, 31-62 (2014).
  22. Deshpande, G. R., et al. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in COVID-19 patients. The Indian Journal of Medical Research. 152 (1 & 2), 82-87 (2020).
  23. Chen, C., et al. Research progress in methods for detecting neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Analytical Biochemistry. 673, 115199 (2023).
  24. Manischewitz, J., et al. Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression. The Journal of Infectious Diseases. 188 (3), 440-448 (2003).
  25. Chen, J., Wang, R., Gilby, N., Wei, G. Omicron Variant (B.1.1.529): Infectivity, Vaccine Breakthrough, and Antibody Resistance. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (2), 412-422 (2022).
  26. Saxena, S. K., et al. Characterization of the novel SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variant of concern and its global perspective. Journal of Medical Virology. 94 (4), 1738-1744 (2022).

Tags

Ha-CoV-2 pseudovirus SARS-CoV-2-varianter nøytraliserende antistoffer rask kvantifisering vaksineeffektivitet pandemiovervåking variantspesifikke boostere hybrid alfavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus smittsomhetsmåling virusvarianter SARS-CoV-2 deltavariant SARS-CoV-2 omikronvariant grønt fluorescerende protein (GFP) Luciferase reportergener
Anvendelse av Ha-CoV-2 pseudovirus for rask kvantifisering av SARS-CoV-2-varianter og nøytraliserende antistoffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chilin, L., Hetrick, B., Wu, Y.… More

Chilin, L., Hetrick, B., Wu, Y. Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies. J. Vis. Exp. (199), e65793, doi:10.3791/65793 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter