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Biology

Biomolecular घनीभूत भीतर प्रोटीन बातचीत गतिशीलता के एकल अणु मापन

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/66169
Automatic Translation
1,2, 1
1Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

Summary

कई आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन को अत्यधिक गतिशील बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट के गठन में भाग लेने के लिए दिखाया गया है, जो कई सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण व्यवहार है। यहां, हम गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक एकल-अणु इमेजिंग-आधारित विधि प्रस्तुत करते हैं जिसके द्वारा प्रोटीन जीवित कोशिकाओं में बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट में एक दूसरे के साथ बातचीत करते हैं।

Abstract

तरल-तरल चरण पृथक्करण (एलएलपीएस) के माध्यम से गठित बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट को सेलुलर संगठन और सेलुलर कार्यों की बढ़ती संख्या में महत्वपूर्ण माना गया है। जीवित कोशिकाओं में एलएलपीएस की विशेषता भी महत्वपूर्ण है क्योंकि असामान्य संघनन को कैंसर और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों सहित कई बीमारियों से जोड़ा गया है। एलएलपीएस अक्सर आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन के बीच चयनात्मक, क्षणिक और बहुसंयोजक बातचीत द्वारा संचालित होता है। एलएलपीएस में भाग लेने वाले प्रोटीन की बातचीत की गतिशीलता बहुत रुचि है, जो उनके बाध्यकारी निवास समय (आरटी) के माप द्वारा अच्छी तरह से सारांशित हैं, अर्थात, वे समय की मात्रा जो वे संघनित के भीतर बाध्य करते हैं। यहां, हम लाइव-सेल सिंगल-अणु इमेजिंग के आधार पर एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो हमें संघनन के भीतर एक विशिष्ट प्रोटीन के औसत आरटी को मापने की अनुमति देता है। हम एक साथ व्यक्तिगत प्रोटीन अणुओं और कंडेनसेट की कल्पना करते हैं जिसके साथ वे संबद्ध होते हैं, एकल-अणु प्रक्षेपवक्र की साजिश रचने के लिए एकल-कण ट्रैकिंग (एसपीटी) का उपयोग करते हैं, और फिर प्रोटीन के औसत आरटी को निकालने के लिए प्रोटीन-बूंद बाध्यकारी के मॉडल में प्रक्षेपवक्र फिट करते हैं। अंत में, हम प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं जहां इस एकल-अणु इमेजिंग विधि को अपने एलएलपीएस कंडेनसेट में प्रोटीन के औसत आरटी की तुलना करने के लिए लागू किया गया था जब एक ऑलिगोमेराइजिंग डोमेन के लिए फ्यूज्ड और अनफ्यूज्ड किया गया था। यह प्रोटोकॉल मोटे तौर पर एलएलपीएस में भाग लेने वाले किसी भी प्रोटीन की बातचीत की गतिशीलता को मापने के लिए लागू होता है।

Introduction

काम के बढ़ते शरीर से पता चलता है कि बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट सेलुलर संगठन और कई सेलुलर कार्यों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, उदाहरण के लिए, ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन 1,2,3,4,5, डीएनए क्षति की मरम्मत 6,7,8, क्रोमैटिन संगठन 9,10,11,12, एक्स-गुणसूत्र निष्क्रियता 13,14,15, और इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग 16,17,18। इसके अलावा, biomolecular घनीभूत के dysregulation कैंसर 19,20,21 और neurodegenerative विकारों 22,23,24,25,26सहित कई रोगों में फंसाया जाता है. घनीभूत गठन अक्सर क्षणिक, चयनात्मक, और बहुसंयोजक प्रोटीन-प्रोटीन, प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड, या न्यूक्लिक एसिड-न्यूक्लिक एसिड इंटरैक्शन27 द्वारा संचालित होता है। कुछ शर्तों के तहत, इन इंटरैक्शन से तरल-तरल चरण पृथक्करण (एलएलपीएस) हो सकता है, एक घनत्व संक्रमण जो स्थानीय रूप से झिल्ली रहित बूंदों में विशिष्ट बायोमोलेक्यूल्स को समृद्ध करता है। इस तरह के बहुसंयोजक बातचीत अक्सर प्रोटीन 1,28,29 के आंतरिक रूप से अव्यवस्थित क्षेत्रों (आईडीआर) द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं. आणविक स्तर पर इन इंटरैक्शन के बायोफिजिकल लक्षण वर्णन कई स्वस्थ और असामान्य सेलुलर कार्यों की हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण है, जो उनके पार घनीभूत की व्यापकता को देखते हैं। हालांकि कॉन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी पर आधारित तकनीकें, उदाहरण के लिए, फोटोब्लीचिंग (एफआरएपी)30,31,32के बाद प्रतिदीप्ति वसूली, व्यापक रूप से गुणात्मक रूप से दिखाने के लिए उपयोग की जाती है कि घनीभूत और आसपास के सेलुलर वातावरण के बीच आणविक आदान-प्रदान गतिशील हैं, कंडेनसेट के भीतर विशिष्ट बायोमोलेक्यूल्स की बातचीत की गतिशीलता को निर्धारित करना आम तौर पर पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी या एकल-अणु का उपयोग करना संभव नहीं है विशेष डेटा विश्लेषण विधियों के बिना माइक्रोस्कोपी। इस प्रोटोकॉल में वर्णित एकल कण ट्रैकिंग (एसपीटी) तकनीक लाइव सेल एकल अणु माइक्रोस्कोपी33 पर आधारित है और संघनन के भीतर विशिष्ट प्रोटीन के बीच बातचीत की गतिशीलता यों के लिए एक विशिष्ट शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है. इस तरह के माप के लिए एसपीटी का रीडआउट कंडेनसेट में रुचि के प्रोटीन का औसत निवास समय है।

प्रोटोकॉल को दो भागों में विभाजित किया जा सकता है - डेटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण। इमेजिंग डेटा अधिग्रहण का पहला कदम कोशिकाओं में ब्याज की एक प्रोटीन है कि एक HaloTag34 से जुड़े हुआ है व्यक्त करने के लिए है. यह दो फ्लोरोफोर्स के साथ ब्याज की प्रोटीन की लेबलिंग को सक्षम बनाता है, जहां अधिकांश प्रोटीन अणुओं को गैर-फोटोएक्टिवेबल फ्लोरोफोर (जैसे, जेएफएक्स 549 हेलो लिगैंड35) के साथ लेबल किया जाना है और उनमें से एक छोटा सा अंश एक वर्णक्रमीय रूप से अलग, फोटोएक्टिवेबल फ्लोरोफोर (जैसे, पीए-जेएफ 646 हेलो लिगैंड36) के साथ लेबल किया जाना है). यह सेल में सभी घनीभूत स्थानों के एक साथ अधिग्रहण और ब्याज बाध्यकारी और संघनन के लिए unbinding के प्रोटीन के एकल अणु फिल्मों के अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है. इस बीच, एक ही प्रकार की कोशिकाओं को हेलो-टैग किए गए एच 2 बी को स्थिर रूप से व्यक्त करने के लिए संशोधित किया जाता है, एक हिस्टोन जो क्रोमैटिन पर काफी हद तक स्थिर है। कोशिकाओं को तब पीए-जेएफ 646 हेलो लिगैंड के साथ दाग दिया जाता है ताकि एच 2 बी के एकल-अणु इमेजिंग को सक्षम किया जा सके। जैसा कि नीचे विस्तार से चर्चा की जाएगी, यह प्रयोग ब्याज की प्रोटीन की बातचीत की गतिशीलता के सटीक मात्रा का ठहराव सक्षम करने के लिए फोटोब्लीचिंग के योगदान के लिए जिम्मेदार है। इमेजिंग प्रयोगों के लिए कोशिकाओं तो साफ coverslips पर सुसंस्कृत किया जाना चाहिए, HaloTag ligand(s) के साथ दाग, और एक लाइव सेल इमेजिंग कक्ष में इकट्ठा. वहां से, नमूना अत्यधिक इच्छुक और टुकड़े टुकड़े में ऑप्टिकल शीट (एचआईएलओ) रोशनी के तहत कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोप पर दो-चैनल इमेजिंग और एकल-अणु का पता लगाने में सक्षम है। उत्सर्जन को तब दो कैमरों पर विभाजित किया जाता है, एक घनीभूत स्थिति पर नज़र रखता है और एक एकल अणुओं पर नज़र रखता है। अधिग्रहण एक लंबे एकीकरण समय (एमएस के सैकड़ों के आदेश पर) के साथ किया जाता है स्वतंत्र रूप से फैलाने प्रोटीन बाहर धुंधला और केवल प्रोटीन है कि सेल37 में स्थिर संरचनाओं के लिए बाध्यकारी होने के कारण कम मोबाइल हैं पर कब्जा.

डेटा विश्लेषण का पहला चरण फिल्म के प्रत्येक फ्रेम में व्यक्तिगत प्रोटीन अणुओं को स्थानीयकृत करने और अपने पता लगाने योग्य जीवनकाल में प्रत्येक अणु के लिए एक प्रक्षेपवक्र में स्थानीयकरण को इकट्ठा करने के लिए एक स्थापित एकल-कण ट्रैकिंग (एसपीटी) एल्गोरिथ्म38,39 का उपयोग कर रहा है। प्रक्षेपवक्र को तब अंदर के अणुओं का प्रतिनिधित्व करने वालों में क्रमबद्ध किया जाता है और जो घनीभूत के बाहर अणुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, उनके प्रक्षेपवक्र में अणुओं के स्थानीयकरण की तुलना संबंधित समय पर सभी कंडेनसेट के स्थानीयकरण से करते हैं1.

अगला, एक उत्तरजीविता वक्र (1 - सीडीएफ) सभी घनीभूत प्रक्षेपवक्र की लंबाई का उपयोग करके उत्पन्न होता है। अणुओं के स्पष्ट औसत निवास समय को प्रोटीन बाइंडिंग के निम्नलिखित दो-घटक घातीय मॉडल में उत्तरजीविता वक्र को फिट करके निकाला जाता है,

Equation 1,

ए के साथ अणुओं के अंश के रूप में गैर-विशेष रूप से बाध्य और केओब्स, एनएस और केओबीएस के साथ, क्रमशः गैर-विशेष रूप से बाध्य और विशेष रूप से बाध्य अणुओं की देखी गई पृथक्करण दर के रूप में। यहाँ से आगे केवल kobs,s माना जाता है। प्रोटीन पृथक्करण, ktrue,s, और फ्लोरोफोर के फोटोब्लीचिंग, kpb दोनों की गतिशीलता, kobs,s में योगदान करती है,

Equation 2;

इस प्रकार, प्रोटीन पृथक्करण के प्रभावों को अलग करने के लिए, पहले उल्लिखित सेल लाइन में एच 2 बी-हेलो की विशिष्ट पृथक्करण दर को मापा जाता है।

Equation 3

एच 2 बी एक प्रोटीन है कि स्थिर क्रोमैटिन में एकीकृत है और है कि एक एकल अणु फिल्म अधिग्रहण37 के समय पैमाने में कम से कम पृथक्करण का अनुभव है. इसकी विशिष्ट पृथक्करण दर तब PA-JF646 हेलो लिगैंड की फोटोब्लीचिंग दर के बराबर होती है, या

Equation 4.

ब्याज के प्रोटीन का मतलब घनीभूत निवास समय, Equation 5, तब है

Equation 6.

Irgen-Gioro et al.40 के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए गए हैं, जहां इस प्रोटोकॉल को यह प्रदर्शित करने के लिए लागू किया गया था कि IDR के लिए एक ऑलिगोमेराइजेशन डोमेन को फ़्यूज़ करने से IDR के लंबे निवास समय में परिणाम होते हैं। इस परिणाम से पता चलता है कि जोड़ा गया ओलिगोमेराइजेशन डोमेन एलएलपीएस को चलाने वाले आईडीआर के होमोटाइपिक इंटरैक्शन को स्थिर करता है। सिद्धांत रूप में, थोड़ा संशोधित प्रोटोकॉल के साथ एक ही विधि को किसी भी प्रोटीन के होमोटाइपिक या हेटरोटाइपिक इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए लागू किया जा सकता है जो किसी भी प्रकार के संघनन के गठन में भाग लेता है।

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Protocol

1. कोशिकाओं में प्रोटीन की लेबलिंग

  1. वांछित सेल लाइन में HaloTag से जुड़े ब्याज की प्रोटीन व्यक्त.
  2. स्थिर रूप से हेलो-टैग किए गए एच 2 बी को उसी प्रकार की कोशिकाओं में व्यक्त करते हैं जैसे कि 1.1 ट्रांसपोज़न या वायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग करके।

2. कवरस्लिप तैयार करना

  1. सेल संस्कृति के लिए coverslips का उपयोग करने से पहले, साफ coverslips autofluorescent दूषित पदार्थों को दूर करने के लिए.
    1. माउंट 25 मिमी व्यास, # 1.5 एक सिरेमिक धुंधला रैक पर coverslips और एक polypropylene कंटेनर में जगह.
    2. पूरी तरह से KOH के एक 1 एम समाधान में coverslips विसर्जित और 1 घंटे के लिए sonicate.
    3. डबल-आसुत जल (डीडीएच2ओ) के साथ तीन बार कुल्ला कुल्ला कवरस्लिप।
    4. पूरी तरह से 100% इथेनॉल में coverslips विसर्जित और 1 घंटे के लिए sonicate.
    5. पूरी तरह से ddH2हे के साथ पतला 20% इथेनॉल में coverslips विसर्जित और उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.

3. माइक्रोस्कोपी के लिए कोशिकाओं की तैयारी

नोट: कोशिकाओं के संदूषण को रोकने के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में इस खंड से कदम उठाएं।

  1. साफ coverslips पर प्लेट कोशिकाओं. इमेजिंग से 2 दिन पहले प्रदर्शन करें यदि हेलो-टैग प्रोटीन क्षणिक रूप से व्यक्त किया जाना है। प्रदर्शन 1 इमेजिंग से पहले दिन अगर हेलो-टैग प्रोटीन stably या अंतर्जात व्यक्त की है.
    1. बाँझ संदंश का उपयोग एक 6 अच्छी तरह से थाली (एक coverslip / अच्छी तरह से सेल नमूना प्रति अच्छी तरह से) में coverslips जगह और अवशिष्ट इथेनॉल लुप्त हो जाना करने के लिए अनुमति देते हैं.
    2. इमेजिंग के समय तक 70% संगम प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की एक उचित संख्या के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से प्लेट. कोशिकाओं के साथ एक अतिरिक्त अच्छी तरह से प्लेट एक ही लक्ष्य संगम के साथ एच 2 बी हेलो व्यक्त करते हैं।
    3. इस चरण का पालन केवल अगर क्षणिक ब्याज की हेलो-टैग प्रोटीन व्यक्त. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं। फिर, प्लाज्मिड एन्कोडिंग ब्याज की टैग प्रोटीन उचित अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग कर और निर्माता के दिशा निर्देशों का पालन के साथ कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट करें.
    4. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. एक गैर photoactivatable हेलो ligand (जैसे, JFX549) और एक photoactivatable हेलो ligand (जैसे, पीए-JF646) दोनों के साथ ब्याज की हेलो-टैग प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं दाग. केवल फोटोएक्टिवेबल हेलो लिगैंड के साथ एच 2 बी-हेलो व्यक्त करने वाली दाग कोशिकाएं।
    नोट: यहां सूचीबद्ध हेलो लिगेंड की सांद्रता का उपयोग प्रारंभिक बिंदु के रूप में किया जाना चाहिए; इष्टतम एकाग्रता अभिव्यक्ति स्तर और ब्याज की प्रोटीन की घनीभूत स्थानीय एकाग्रता पर निर्भर करेगा।
    1. ब्याज की हेलो-टैग प्रोटीन व्यक्त करने वाले प्रत्येक सेल नमूने के लिए, उपयुक्त सेल मीडिया के 500 माइक्रोन में 100 एनएम जेएफएक्स 549 हेलो लिगैंड35 और 20 एनएम पीए-जेएफ 646 हेलो लिगैंड36 को पतला करें। एच 2 बी-हेलो व्यक्त करने वाले प्रत्येक नमूने के लिए, उपयुक्त सेल मीडिया के 500 माइक्रोन में केवल 20 एनएम पीए-जेएफ 646 हेलो लिगैंड को पतला करें।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए, मौजूदा मीडिया महाप्राण, 1x पीबीएस के 2 एमएल जोड़ने, तो पीबीएस महाप्राण (यह प्रोटोकॉल के शेष के लिए एक "कुल्ला" के रूप में संदर्भित किया जाता है), और उपयुक्त हेलो ligands युक्त मीडिया के साथ की जगह.
    3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    4. पीबीएस के साथ चार बार कुल्ला और कोई हेलो ligands युक्त ताजा मीडिया के साथ की जगह.
    5. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    6. दोहराएँ कदम 3.2.4 और 3.2.5 तीन बार (चार कुल्ला-इनक्यूबेशन चक्र कुल).
    7. माइक्रोस्कोप चरण के साथ संगत एक सेल संस्कृति coverslip कक्ष के लिए कोशिकाओं के साथ coverslip हस्तांतरण करने के लिए बाँझ संदंश का प्रयोग करें.
    8. कक्ष में फिनोल लाल मुक्त मीडिया जोड़ें और इमेजिंग के लिए आगे बढ़ें। नमूनों को तुरंत 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर चित्रित नहीं किया जा रहा है जब तक कि आवश्यक न हो।

4. एकल-अणु इमेजिंग

नोट: एच 2 बी और ब्याज की प्रोटीन दोनों के निवास समय को मापने वाले स्वतंत्र प्रयोगों को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिणाम उत्पन्न करने के लिए कई (≥3) दिनों में आयोजित किया जाना चाहिए। माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग सेल के नमूनों से पहले, 0.1 माइक्रोन सना हुआ microspheres (सामग्री की तालिका) या एक समान अंशांकन मानक का उपयोग कर दो कैमरों संरेखित करें.

  1. सूक्ष्मदर्शी तैयार करें।
    1. माइक्रोस्कोप और माइक्रोस्कोप को नियंत्रित करने वाले कंप्यूटर को चालू करें।
    2. माइक्रोस्कोप पर लाइव-सेल इनक्यूबेशन घटकों (हीटर और सीओ2) को चालू करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेट करें। सिस्टम को संतुलित करने की अनुमति दें।
    3. माइक्रोस्कोप पर एक 100x TIRF तेल विसर्जन उद्देश्य पर उपयुक्त तेल की एक बूंद रखो और खुर्दबीन मंच पर सेल नमूना लोड.
  2. छवि के लिए एक सेल की पहचान करें।
    1. ब्राइटफील्ड रोशनी के तहत सेल नमूना छवि और जेड स्थिति को समायोजित जब तक कोशिकाओं फोकस में हैं.
    2. एक ऐसी कोशिका की पहचान कीजिए जो स्वस्थ कोशिकाओं की आकृति विज्ञान विशेषताओं को प्रदर्शित करती है।
    3. देखने के क्षेत्र (एफओवी) फसल इतना है कि यह केवल लक्ष्य सेल नाभिक कब्जा.
    4. लेजर रोशनी का उपयोग करें और TIRF कोण को समायोजित करें जब तक कि एकल अणुओं के इष्टतम सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ HILO रोशनी41 प्राप्त न हो जाए।
  3. छवि एच 2 बी हेलो जीवित कोशिकाओं में।
    नोट: इस खंड में उपयोग की जाने वाली लेजर शक्तियां इस प्रयोग के लिए विशिष्ट हैं और एक उदाहरण के रूप में शामिल हैं। चर्चा में सूचीबद्ध मानदंडों के अनुसार उपयुक्त लेजर शक्तियों का चयन किया जाना चाहिए।
    1. निम्नानुसार एक अधिग्रहण कॉन्फ़िगरेशन सेट करें। एक्सपोज़र का समय 500 एमएस के रूप में सेट करें। प्रत्येक 500 एमएस एक्सपोजर के दौरान, पीए-जेएफ 646 लेबल एच 2 बी-हेलो अणुओं को 9.1 मेगावाट, 640 एनएम बीम के साथ उत्तेजित करें। फ्रेम के बीच मृत समय के दौरान (यहां इस्तेमाल की गई इमेजिंग सिस्टम पर 158.01 μs), अणुओं को 111 μW, 405 एनएम बीम के साथ फोटोएक्टिवेट करें।
    2. इन सेटिंग्स के तहत लगातार 2000 फ्रेम कैप्चर करें। धीरे-धीरे अधिग्रहण के दौरान 405 एनएम बीम की शक्ति में वृद्धि करें जब फोटोएक्टिवेटेड अणुओं की संख्या अपर्याप्त हो जाती है।
  4. छवि जीवित कोशिकाओं में ब्याज की हेलो-टैग प्रोटीन की छवि.
    1. दो कैमरों के बीच उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को विभाजित करने के लिए एक लंबे समय से पास डाइक्रोइक दर्पण का उपयोग करें, एक पीए-जेएफ 646 का पता लगाने के लिए और दूसरा जेएफएक्स 549 का पता लगाने के लिए। कैमरों के सामने उपयुक्त उत्सर्जन फिल्टर का प्रयोग करें।
    2. निम्न संशोधन के साथ 4.3.1 में वर्णित समान अधिग्रहण कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग करें। समय के साथ हेलो-टैग किए गए प्रोटीन घनीभूत के स्थानों को ट्रैक करने के लिए एक अतिरिक्त JFX549 चैनल जोड़ें। प्रत्येक 10 एस, पीए-जेएफ 646 चैनल के अधिग्रहण को ध्यान में रखते हुए जेएफएक्स 549 चैनल में एक फ्रेम (500 एमएस, 2.1 मेगावाट, 561 एनएम उत्तेजना) प्राप्त करें। यह PA-JF646 चैनल में ब्लीडथ्रू का कारण बनेगा, जिसका अधिग्रहण के बाद के डेटा विश्लेषण में ध्यान रखा जाएगा।
    3. इन सेटिंग्स के तहत लगातार 2000 फ्रेम कैप्चर करें। धीरे-धीरे अधिग्रहण के दौरान 405 एनएम बीम की शक्ति में वृद्धि करें जब फोटोएक्टिवेटेड अणुओं की संख्या अपर्याप्त हो जाती है।

5. एकल-अणु इमेजिंग डेटा का विश्लेषण

नोट: धारा 5 में उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर इस प्रयोग के लिए विशिष्ट हैं और एक उदाहरण के रूप में शामिल हैं। चर्चा में सूचीबद्ध मानदंडों के अनुसार उपयुक्त मापदंडों का चयन किया जाना चाहिए।

  1. प्रसंस्करण के लिए कच्चे इमेजिंग डेटा तैयार करें।
    1. ब्याज की प्रोटीन के डेटा के लिए, कच्चे इमेजिंग डेटा फ़ाइल से प्रत्येक चैनल को इमेजजे या इसी तरह की छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक स्वतंत्र .tif फ़ाइल में परिवर्तित करें। H2B के डेटा के लिए, कच्चे इमेजिंग डेटा फ़ाइल से एकल चैनल को उसी तरह .tif फ़ाइल में परिवर्तित करें।
      नोट: उपयोग किए जा रहे अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर के आधार पर, घनीभूत फिल्म में खाली फ्रेम हो सकते हैं, क्योंकि हर 10 सेकंड में केवल एक घनीभूत-ट्रैकिंग फ्रेम लिया जाता है। खाली फ्रेम को सबसे हाल के घनीभूत फ्रेम के साथ आबाद किया जाना चाहिए (कुछ अधिग्रहण सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से ऐसा करता है)। इसके अतिरिक्त, यदि उन घनीभूत-ट्रैकिंग फ़्रेमों के दौरान घनीभूत (JFX549) चैनल से एकल-अणु (PA-JF646) चैनल में महत्वपूर्ण ब्लीडथ्रू है, तो संबंधित एकल-अणु फ़्रेम को सबसे हाल ही में एकल-अणु फ्रेम से बदला जाना चाहिए।
    2. यदि उपरोक्त कारणों से किसी भी फिल्म में प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता है, तो उन्हें उस फिल्म से सबसे हाल के फ्रेम के साथ बदलें (यदि आवश्यक हो) और pretracking_comb.txt चलाकर, चोंग एट अल 1 में उपलब्ध एक इमेजजे मैक्रो, और संकेतों का पालन करें।
  2. एक एसपीटी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एकल कण प्रक्षेपवक्र उत्पन्न करें, उदाहरण के लिए, SLIMfast39, Teves एट अल 42 में उपलब्ध MTT एल्गोरिथ्म38 के एक जीयूआई कार्यान्वयन.
    1. लोड > इमेजस्टैक पर क्लिक करके SLIMfast में सिंगल-मॉलिक्यूल मूवी वाली 5.1.2 से फ़ाइल लोड करें।
    2. पैरामीटर सेट करें (स्थानीयकरण त्रुटि दर: 10-6; अपस्फीति लूप: 3) ऑप्ट > शीट पर क्लिक करके स्थानीयकरण के लिए : स्थानीयकरण।
    3. पैरामीटर सेट करें (पीक उत्सर्जन: 664 एनएम; अंतराल समय: 500 एमएस) ऑप्ट > शीट: अधिग्रहण पर क्लिक करके अधिग्रहण के लिए।
    4. एक ही फ्रेम में सभी अणुओं के स्थानीयकरण की कल्पना करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि चुने गए पैरामीटर उपयुक्त हैं (टेस्ट एलओसी)। यदि अनुपयुक्त है, तो चरण 5.2.2 और 5.2.3 में पैरामीटर संशोधित करें और इस चरण को दोहराएं।
    5. प्रत्येक फ्रेम (एलओसी ऑल) में सभी अणुओं के स्थानीयकरण वाली एक फ़ाइल उत्पन्न करें।
    6. SLIMfast में 5.2.5 से लोड > कण डेटा > SLIMfast क्लिक करके फ़ाइल लोड करें।
    7. पैरामीटर सेट करें (अधिकतम अपेक्षित प्रसार गुणांक: 0.1 माइक्रोन2/एस; प्रतियोगियों की अधिकतम संख्या: 5) ऑप्ट > शीट: ट्रैकिंग पर क्लिक करके प्रक्षेपवक्र पीढ़ी के लिए।
    8. सभी अणुओं (जनरल TRAJ) के प्रक्षेपवक्र युक्त एक फ़ाइल उत्पन्न करें।
  3. ड्रोसोपोलोस एट अल.43 में उपलब्ध evalSPT39 का उपयोग करके t min, 2.5 s से कम होने वाले प्रक्षेपवक्र को फ़िल्टर करें, ताकि ट्रैकिंग त्रुटियों के लिए जिम्मेदार हो सके जिसके परिणामस्वरूप कृत्रिम रूप से कम प्रक्षेपवक्र होते हैं।
    1. फ़ाइल को 5.2.8 से evalSPT में लोड करें (+ > फ़ाइल 5.2.8 से > OK)।
    2. पैरामीटर सेट करें (न्यूनतम: 5 फ्रेम; अधिकतम: 5.2.8 से फ़ाइल के लिए अधिकतम प्रक्षेपवक्र लंबाई) 2.5 एस से कम प्रक्षेपवक्र को फ़िल्टर करने के लिए।
    3. सभी फ़िल्टर किए गए प्रक्षेपवक्र (निर्यात डेटा) के साथ एक फ़ाइल उत्पन्न करें।
  4. केवल ब्याज की प्रोटीन के प्रक्षेपवक्र के लिए इस कदम का पालन करें. प्रक्षेपवक्र को घनीभूत और संघनन से बाहर क्रमबद्ध करें, फिर माध्य इन-कंडेनसेट निवास समय निकालें।
    नोट: इस खंड के लिए सभी कोड चोंग एट अल 1 में उपलब्ध हैं।
    1. JFX549 चैनल में अधिग्रहित फिल्म के सभी फ़्रेमों को थ्रेसहोल्ड करें ताकि समय-विकसित बाइनरी मास्क के साथ आबादी वाली टाइम-लैप्स मूवी उत्पन्न की जा सके, जो ImageJ मैक्रो, न्यूक्लियस और क्लस्टर mask_v2.txt चलाकर और संकेतों का पालन करके घनीभूत स्थानों को हाइलाइट करता है।
    2. 5.3.3 में उत्पन्न एकल-अणु प्रक्षेपवक्र को सुधारें। MATLAB स्क्रिप्ट का उपयोग करना, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, और आवश्यकतानुसार फ़ाइल नाम, पथ और पैरामीटर समायोजित करना। (पैरामीटर: एक्सपोजर, 0.5 एस; संकल्प, 0.16 माइक्रोन /
    3. जीवनकाल के अंश के आधार पर प्रक्षेपवक्र को क्रमबद्ध करें जो किसी दिए गए अणु एक घनीभूत, एफ में खर्च करता है, MATLAB स्क्रिप्ट, categorization_v4.m, का उपयोग करके, और आवश्यकतानुसार फ़ाइल नाम और पथ समायोजित करता है।
    4. केवल घनीभूत प्रक्षेपवक्र का उपयोग करके आगे बढ़ें।
  5. kobs,s और kpb निकालें और सही औसत निवास समय की गणना करें। Equation 6
    1. MATLAB स्क्रिप्ट, PLOT_ResidenceHist_css.m, और आवश्यकतानुसार फ़ाइल नाम, पथ और मापदंडों को समायोजित करके ब्याज प्रक्षेपवक्र के इन-घनीभूत प्रोटीन से k obs, s निकालें।
      (पैरामीटर: एक्सपोजर, 0.5 एस; StartFrameForFit, 5 फ्रेम)।
    2. MATLAB स्क्रिप्ट, PLOT_ResidenceHist_css.m का उपयोग करके H2B प्रक्षेपवक्र से kpb निकालें, और आवश्यकतानुसार फ़ाइल नाम, पथ और पैरामीटर समायोजित करें।
      (पैरामीटर: एक्सपोजर, 0.5 एस; StartFrameForFit, 5 फ्रेम)।
    3. ब्याज के प्रोटीन के सही औसत निवास समय की गणना करें जो विशेष रूप से इसके संघनन से बंधे हैं, Equation 6जैसा कि
      Equation 7
      नोट: नियंत्रण यह सत्यापित करने के लिए किया जाना चाहिए कि अलग-अलग एक्सपोज़र समय जो मोबाइल कणों को धुंधला करने के लिए काफी लंबा है, उदाहरण के लिए, 300 एमएस और 800 एमएस, अभी भी ब्याज की प्रोटीन के समान औसत निवास समय में परिणाम देते हैं।

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Representative Results

यहां, हम इरगेन-गियोरो एट अल.40 से प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करते हैं, जहां हमने इस एसपीटी प्रोटोकॉल का उपयोग उनके संबंधित स्व-इकट्ठे एलएलपीएस संघनन में दो प्रोटीनों की बातचीत की गतिशीलता की तुलना करने के लिए किया था। TAF15 (टाटा-बॉक्स बाइंडिंग प्रोटीन जुड़े कारक 15) में एक IDR होता है जो मानव कोशिकाओं में अतिअभिव्यक्ति पर LLPS से गुजर सकता है। हमने अनुमान लगाया कि टीएएफ 15 (आईडीआर) को एफटीएच 1 (फेरिटिन भारी श्रृंखला 1) में फ्यूज करना, जो 24-सबयूनिट ओलिगोमर बनाता है, एलएलपीएस को चलाने वाले अधिक स्थिर होमोटाइपिक प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को जन्म देगा। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हमने यू 2 ओएस कोशिकाओं में या तो हेलो-टीएएफ 15 (आईडीआर) या टीएएफ 15 (आईडीआर) -हेलो-एफटीएच 1 संलयन व्यक्त किया और उपरोक्त प्रोटोकॉल के बाद प्रत्येक प्रोटीन के दो-रंग एकल-अणु इमेजिंग का प्रदर्शन किया। TAF15 (IDR) -हेलो-FTH1 फिल्म से एक प्रतिनिधि फ्रेम चित्र 1A में दिखाया गया है। पीए-जेएफ 646 चैनल में पाए गए अणुओं को स्थानीयकृत किया गया था, और उन स्थानीयकरणों को प्रक्षेपवक्र में इकट्ठा किया गया था। परिणामी प्रक्षेपवक्र तब घनीभूत स्थानों (चित्रा 1 बी) को उजागर करने वाले बाइनरी मास्क के खिलाफ तुलना करके इन-कंडेनसेट और आउट-ऑफ-कंडेनसेट आबादी के बीच क्रमबद्ध किए गए थे। जबकि हम केवल अच्छी दृश्यता के लिए प्रक्षेपवक्र का एक छोटा सा अंश दिखाते हैं, घनीभूत से बंधे अणुओं के प्रक्षेपवक्र और संघनन के बाहर बंधे के बीच एक स्पष्ट अंतर है। अगला, इन-कंडेनसेट प्रक्षेपवक्र लंबाई का एक उत्तरजीविता वक्र दो-घटक घातीय मॉडल(चित्रा 1सी)के खिलाफ फिट किया गया था। अंत में, फोटोब्लीचिंग के लिए सुधार के बाद औसत निवास समय निकाला गया और दोनों प्रोटीन(चित्रा 1डी)के लिए प्लॉट किया गया। हमने पाया कि इसके एलएलपीएस संघनन में हेलो-टीएएफ15 (आईडीआर) का औसत निवास समय 10.23 सेकेंड ± 1.10 सेकेंड था, जबकि टीएएफ15 (आईडीआर) -हेलो-एफटीएच 1 का 64.15 सेकेंड ± 11.65 सेकेंड था। इस परिणाम से पता चलता है कि TAF15 (IDR) में ऑलिगोमेराइजिंग डोमेन के अलावा वास्तव में प्रोटीन-कंडेनसेट बाइंडिंग को स्थिर करता है।

Figure 1
चित्रा 1: एसपीटी-आधारित विधि उनके संघनन में प्रोटीन के निवास समय में अंतर को हल करती है। ए। TAF15 (IDR) -Halo-FTH1 की दो-रंग एकल-अणु फिल्म से प्रतिनिधि फ्रेम। प्रोटीन को गैर-फोटोएक्टिवेबल डाई (100 एनएम JFX549, पीला) की उच्च सांद्रता के संयोजन के साथ लेबल किया गया था ताकि संघनन के स्थानों की कल्पना की जा सके, और व्यक्तिगत प्रोटीन की कल्पना करने के लिए फोटोएक्टिवेबल डाई (20 एनएम पीए-जेएफ 646, मैजेंटा) की कम एकाग्रता, एसपीटी को सक्षम करने के लिए। एक ही इमेजिंग स्थितियों के तहत फिल्में हेलो-टीएएफ 15 (आईडीआर) के लिए अधिग्रहित की गईं और एकल-चैनल, पीए-जेएफ 646 फिल्मों को एच 2 बी-हेलो के लिए अधिग्रहित किया गया था। एक सफेद धराशायी रेखा नाभिक को रेखांकित करती है। बी प्रतिनिधि ने घनीभूत स्थिति (ग्रे) और प्रक्षेपवक्र (बहुरंगी) के एक द्विआधारी मुखौटा को ओवरले करने वाली छवि को मर्ज किया। C. TAF15(IDR)-Halo-FTH1 का प्रतिनिधि उत्तरजीविता वक्र दो-घटक घातीय मॉडल के साथ लगाया गया। D. हेलो-टीएएफ15 का औसत निवास समय उनके संबंधित संघनन में TAF15(IDR)-Halo-FTH1 की तुलना में काफी कम था। प्रत्येक प्रोटीन के लिए मूल्य तीन दिनों में प्रदर्शन किए गए स्वतंत्र प्रयोगों में मापा 20 कोशिकाओं से औसत था। त्रुटि को माध्य की मानक त्रुटि के रूप में प्रचारित किया गया था और तारांकन दो प्रोटीनों (पी <0.05, विलकॉक्सन रैंक-योग परीक्षण) के निवास समय में एक महत्वपूर्ण अंतर का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा इरगेन-जियोरो एट अल.40 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रोटोकॉल के रूप में यहाँ प्रस्तुत Irgen-Gioro एट al.40 में जांच की उन लोगों की तरह सिस्टम के लिए बनाया गया है. आवेदन के आधार पर, प्रोटोकॉल के कुछ घटकों को संशोधित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंटली लेबल सेल लाइनों, फ्लोरोसेंट लेबलिंग सिस्टम, और कवरस्लिप की शैली का उपयोग करने की विधि। एक सेल में एक प्रोटीन के हेलो-टैगिंग दो रणनीतियों का उपयोग करके किया जा सकता है, जिसके आधार पर किसी दिए गए प्रयोग के लिए अधिक उपयुक्त है। 1) बहिर्जात अभिव्यक्ति: एक हेलोटैग के लिए ब्याज की प्रोटीन फ्यूज और एक लक्ष्य सेल लाइन में संलयन व्यक्त या तो क्षणिक अभिकर्मक का उपयोग कर या स्थिर transposons या वायरल पारगमन का उपयोग कर. 2) जीनोम संपादन: जीनोम संपादन तकनीकों का उपयोग करके लक्ष्य सेल लाइन में ब्याज की अंतर्जात प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले जीन लोकस पर एक हेलोटैग में दस्तक दें, उदाहरण के लिए, सीआरआईएसपीआर44। लाभ और प्रत्येक की कमियांकहीं और 45 चर्चा कर रहे हैं, लेकिन संक्षेप में, बहिर्जात अभिव्यक्ति रणनीति कम समय लेने वाली है, लेकिन अभिव्यक्ति के स्तर है कि अक्सर गैर शारीरिक होते हैं की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ कोशिकाओं की आबादी पैदा करता है. जीनोम संपादन रणनीति में अधिक समय लगता है, लेकिन लेबल अपने मूल अभिव्यक्ति स्तरों पर ब्याज के अंतर्जात व्यक्त प्रोटीन को लेबल करते हैं।

इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को विशेष रूप से हेलोटैग के उपयोग की आवश्यकता नहीं है; बल्कि, यह किसी भी टैग के साथ संगत है जो सेल में एक ही प्रोटीन के एक साथ एकल-अणु और पहनावा लेबलिंग को सक्षम बनाता है। इस प्रकार, प्रोटोकॉल स्नैप टैग46 की तरह अन्य स्वयं लेबलिंग टैग के साथ उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है. अंत में, सेल कल्चर के लिए प्रीक्लीन, वाणिज्यिक ग्लास-बॉटम व्यंजन, जैसे कि मैटटेक व्यंजन (मैटटेक लाइफ साइंसेज, पी 35 जी-1.5-20-सी), का उपयोग कवरस्लिप कक्षों के बजाय किया जा सकता है, बशर्ते कि वे माइक्रोस्कोप उद्देश्य और विसर्जन तेल के साथ संगत हों; हालांकि, कवरस्लिप को उपयोग करने से तुरंत पहले अधिक अच्छी तरह से साफ किया जा सकता है, इस प्रकार बेहतर होता है।

जबकि प्रोटोकॉल में उपरोक्त संशोधन वैकल्पिक हैं, प्रयोगात्मक और विश्लेषण पैरामीटर हैं जिन्हें अनुकूलित किया जाना चाहिए, अर्थात्, हेलोटैग लिगैंड्स की सांद्रता, लेजर शक्तियां, स्थानीयकरण और ट्रैकिंग पैरामीटर, और टीमिनट। गैर-फोटोएक्टिवेबल हेलोटैग लिगैंड की एकाग्रता को इस तरह चुना जाना चाहिए कि घनीभूत को मुखौटा पीढ़ी को सक्षम करने के लिए घनी रूप से पर्याप्त लेबल किया जाए। फोटोएक्टिवेटेबल हेलोटैग लिगैंड और फोटोएक्टिवेशन लेजर पावर की एकाग्रता को इस तरह चुना जाना चाहिए कि प्रोटीन अणुओं को लेबल किया जाता है और गुणवत्ता एकल-कण प्रक्षेपवक्र उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त रूप से फोटोएक्टिवेट किया जाता है, क्योंकि प्रत्येक फ्रेम में स्थानीयकरण की अधिकता के परिणामस्वरूप गलत प्रक्षेपवक्र पीढ़ी होगी। प्रतिनिधि परिणामों में दिखाए गए प्रयोगों के लिए, आम तौर पर प्रति फ्रेम पांच से कम स्थानीयकरण थे। उत्तेजना लेजर शक्ति तेजी से photobleaching को कम करने के लिए काफी कम रखा जाना चाहिए, लेकिन उच्च पर्याप्त उच्च ठीक एकल अणुओं स्थानीयकृत करने के लिए. एकल अणु स्थानीयकरण और ट्रैकिंग मापदंडों उत्तेजनाओं के घनत्व और ब्याज की प्रोटीन की उम्मीद प्रसार गतिशीलता के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए. अंत में, के Equation 6 मूल्यों की गणना टीमिनट की एक सीमा में की जानी चाहिए (0 एस से शुरू होकर एक्सपोजर समय की वृद्धि में वृद्धि)। के Equation 6 मान को tmin की कुछ सीमा से ऊपर अभिसरण करना चाहिए; इस tmin का उपयोग चरण 5.3 में किया जाना चाहिए।

विधि यहाँ उल्लिखित एक परिशुद्धता है कि पारंपरिक तकनीकों के लिए दुर्गम है के साथ घनीभूत भीतर प्रोटीन की बातचीत की गतिशीलता यों यों करता है. इसके अलावा, यह न्यूनतम नमूना गड़बड़ी के साथ जीवित कोशिकाओं में ऐसा कर सकता है। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि आईडीआर के इंटरैक्शन व्यवहार, उनके घनीभूत गठन सहित, उनके स्थानीय वातावरण40 पर अत्यधिक निर्भर हैं।

Irgen-Gioro et al.40 के प्रतिनिधि परिणाम इस पद्धति की क्षमता को प्रदर्शित करते हैं कि वे अपने स्व-इकट्ठे एलएलपीएस संघनन के लिए बाध्य प्रोटीन के लिए निवास समय निकालें। महत्वपूर्ण बात, इस विधि आसानी से homotypic या heterotypic बातचीत के माध्यम से घनीभूत के किसी भी प्रकार के लिए बाध्यकारी किसी भी प्रोटीन के लिए विस्तार किया जा सकता है. इसके अलावा, यह एलएलपीएस से गुजरने वाले प्रोटीन की बातचीत की गतिशीलता को मापने तक सीमित नहीं है। फ्यूजन ऑनकोप्रोटीन ईडब्ल्यूएस :: एफएलआई 1, जो इविंग सरकोमा का कारण बनता है, को स्थानीय, उच्च सांद्रता वाले हब बनाने के लिए दिखाया गया है जो इसके ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण और ऑन्कोजेनिक परिवर्तन कार्यों 1,2में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। जबकि इन केंद्रों का गठन ईडब्ल्यूएस :: एफएलआई 1 के क्षणिक, चयनात्मक और बहुसंयोजक आईडीआर-आईडीआर इंटरैक्शन द्वारा संचालित है, अब तक, अभी भी कोई ठोस सबूत नहीं है कि वे वास्तविक एलएलपीएस 1,2 संघनित हैं। फिर भी, हमने इसके हब पर EWS::FLI1 के औसत निवास समय को मापने के लिए यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग किया और दिखाया कि विशिष्ट अवशेषों के उत्परिवर्तन और इसके IDR के विलोपन ने EWS::FLI1 के बंधन को इसके हब1 में काफी अस्थिर कर दिया।

संघनन के भीतर प्रोटीन की बाध्यकारी गतिशीलता को चिह्नित करने में इस पद्धति की बहुमुखी प्रतिभा के बावजूद, विशिष्ट संदर्भों में प्रोटीन बाध्यकारी के लिए मॉडल चुनते समय सावधानी बरतनी चाहिए। मौजूदा जैव रासायनिक डेटा इस विचार का समर्थन करता है कि दो-घटक घातीय वितरण अक्सर कई प्रणालियों 1,37,40,42 के लिए एक उपयुक्त मॉडल होता है, लेकिन एक ही वितरण को अन्य प्रणालियों में प्रोटीन बाध्यकारी का अनुचित प्रतिनिधित्व भी दिखाया गया है जहां वैकल्पिक मॉडल जैसे तीन-घटक घातीय 47,48,49, और बिजली-कानून वितरण50 प्रयोगात्मक टिप्पणियों से बेहतर मिलान करें। गलत निष्कर्ष निकालने से बचने के लिए, किसी को सावधानीपूर्वक एक मॉडल चुनना और प्रेरित करना चाहिए, यह सत्यापित करना चाहिए कि फिट की गुणवत्ता मॉडल के उपयोग का समर्थन करती है, और परिणामों की विवेकपूर्ण व्याख्या करती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस कार्य को राष्ट्रीय विज्ञान प्रतिष्ठान द्वारा अनुदान सं 2005 के अंतर्गत स्नातक अनुसंधान अध्येतावृत्ति द्वारा सहायता प्रदान की गई थी। DGE-1745301 (S.Y.), प्यू-स्टीवर्ट स्कॉलर अवार्ड (S.C.), Searle Scholar अवार्ड (S.C.), Shurl and Kay Curci Foundation रिसर्च ग्रांट (S.C.), Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), Mallinckrodt Research Grant (S.C.), और मार्गरेट E. अर्ली मेडिकल रिसर्च ट्रस्ट 2024 ग्रांट (एससी)। एससी को पुरस्कार संख्या P30CA016042 के तहत एनआईएच/एनसीआई द्वारा भी समर्थन प्राप्त है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 µm TetraSpeck microsphere Invitrogen T7279 Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips Marienfeld Superior 111650 Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filter Semrock FF01-593/40-25 Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filter Semrock FF01-676/37-25 Single-molecule imaging
6-Well TC Plate Genesee 25-105MP Preparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OS ATCC HTB-96 Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		 Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining Rack Thomas 24957 Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549) Janelia Research Campus Preparation of cells for microscopy
DMEM, Low Glucose Gibco 10-567-022 Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope Nikon Single-molecule imaging
Ethanol 200 Proof Lab Alley EAP200-1GAL Preparation of coverslips
evalSPT Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine Serum Cytiva SH30396.03 Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Fiji Analysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD Camera Andor X-13723 Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitter Semrock Di02-R635-25x36 Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser Unit Nikon Single-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-20-C Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-Elements Nikon Single-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txt Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-Streptomycin Gibco 15-140-122 Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 18912014 Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646) Janelia Research Campus Preparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.m Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium Hydroxide Mallinckrodt Chemicals 6984-06 Preparation of coverslips
pretracking_comb.txt Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfast Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation system Tokai Hit Single-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitter Cairn Research Single-molecule imaging
Ultrasonic Cleaner Branson 5800 Preparation of coverslips

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References

  1. Chong, S., et al. Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. Science. 361 (6400), (2018).
  2. Chong, S., Graham, T. G. W., Dugast-Darzacq, C., Dailey, G. M., Darzacq, X., Tjian, R. Tuning levels of low-complexity domain interactions to modulate endogenous oncogenic transcription. Molecular Cell. 82 (11), 2084-2097 (2022).
  3. Boehning, M., et al. RNA polymerase II clustering through carboxy-terminal domain phase separation. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (9), 833-840 (2018).
  4. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), New York, N.Y. (2018).
  5. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  6. Levone, B. R., et al. FUS-dependent liquid-liquid phase separation is important for DNA repair initiation. Journal of Cell Biology. 220 (5), e202008030 (2021).
  7. Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. The EMBO Journal. 38 (16), e101379 (2019).
  8. Pessina, F., et al. Functional transcription promoters at DNA double-strand breaks mediate RNA-driven phase separation of damage-response factors. Nature Cell Biology. 21 (10), 1286-1299 (2019).
  9. Nozaki, T., et al. Condensed but liquid-like domain organization of active chromatin regions in living human cells. Science Advances. 9 (14), (2023).
  10. Maeshima, K., et al. Nucleosomal arrays self-assemble into supramolecular globular structures lacking 30-nm fibers. The EMBO Journal. 35 (10), 1115-1132 (2016).
  11. Strickfaden, H., Tolsma, T. O., Sharma, A., Underhill, D. A., Hansen, J. C., Hendzel, M. J. Condensed chromatin behaves like a solid on the mesoscale in vitro and in living cells. Cell. 183 (7), 1772-1784 (2020).
  12. Gibson, B. A., et al. Organization of chromatin by intrinsic and regulated phase separation. Cell. 179 (2), 470-484 (2019).
  13. Cerase, A., Armaos, A., Neumayer, C., Avner, P., Guttman, M., Tartaglia, G. G. Phase separation drives X-chromosome inactivation: a hypothesis. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (5), 331-334 (2019).
  14. Jachowicz, J. W., Strehle, M., Banerjee, A. K., Blanco, M. R., Thai, J., Guttman, M. Xist spatially amplifies SHARP/SPEN recruitment to balance chromosome-wide silencing and specificity to the X chromosome. Nature Structural & Molecular Biology. 29 (3), 239-249 (2022).
  15. Pandya-Jones, A., et al. A protein assembly mediates Xist localization and gene silencing. Nature. 587 (7832), 145-151 (2020).
  16. Du, M., Chen, Z. J. DNA-induced liquid phase condensation of cGAS activates innate immune signaling. Science. 361 (6403), 704-709 (2018).
  17. Zamudio, A. V., et al. Mediator condensates localize signaling factors to key cell identity genes. Molecular Cell. 76 (5), 753-766 (2019).
  18. Zhang, J. Z., et al. Phase separation of a PKA regulatory subunit controls cAMP compartmentation and oncogenic signaling. Cell. 182 (6), 1531-1544 (2020).
  19. Kovar, H. Dr. Jekyll and Mr. Hyde: The two faces of the FUS/EWS/TAF15 protein family. Sarcoma. 2011, e837474 (2010).
  20. Linardic, C. M. PAX3-FOXO1 fusion gene in rhabdomyosarcoma. Cancer Letters. 270 (1), 10-18 (2008).
  21. Ahn, J. H., et al. Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development. Nature. 595 (7868), 591-595 (2021).
  22. Wegmann, S., et al. Tau protein liquid-liquid phase separation can initiate tau aggregation. The EMBO Journal. 37 (7), e98049 (2018).
  23. Friedman, M. J., et al. Polyglutamine domain modulates the TBP-TFIIB interaction: implications for its normal function and neurodegeneration. Nature Neuroscience. 10 (12), 1519-1528 (2007).
  24. Molliex, A., et al. Phase separation by low complexity domains promotes stress granule assembly and drives pathological fibrillization. Cell. 163 (1), 123-133 (2015).
  25. Murakami, T., et al. ALS/FTD mutation-induced phase transition of FUS liquid Droplets and reversible hydrogels into irreversible hydrogels impairs RNP granule function. Neuron. 88 (4), 678-690 (2015).
  26. Patel, A., et al. A liquid-to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mutation. Cell. 162 (5), 1066-1077 (2015).
  27. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  28. Kato, M., McKnight, S. L. A solid-state conceptualization of information transfer from gene to message to protein. Annual Review of Biochemistry. 87, 351-390 (2018).
  29. Li, P., et al. Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. Nature. 483 (7389), 336-340 (2012).
  30. Muzzopappa, F., et al. Detecting and quantifying liquid-liquid phase separation in living cells by model-free calibrated half-bleaching. Nature Communications. 13 (1), 7787 (2022).
  31. Sprague, B. L., Müller, F., Pego, R. L., Bungay, P. M., Stavreva, D. A., McNally, J. G. Analysis of binding at a single spatially localized cluster of binding sites by fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 91 (4), 1169-1191 (2006).
  32. Taylor, N. O., Wei, M. -T., Stone, H. A., Brangwynne, C. P. Quantifying dynamics in phase-separated condensates using fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 117 (7), 1285-1300 (2019).
  33. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  34. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  35. Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores using deuterated auxochromes. JACS Au. 1 (5), 690-696 (2021).
  36. Grimm, J. B., et al. photoactivatable fluorophores for single-molecule imaging. Nature Methods. 13 (12), 985-988 (2016).
  37. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. eLife. 6, 25776 (2017).
  38. Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
  39. Normanno, D., et al. Probing the target search of DNA-binding proteins in mammalian cells using TetR as model searcher. Nature Communications. 6 (1), 7357 (2015).
  40. Irgen-Gioro, S., Yoshida, S., Walling, V., Chong, S. Fixation can change the appearance of phase separation in living cells. eLife. 11, e79903 (2022).
  41. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  42. Teves, S. S., An, L., Hansen, A. S., Xie, L., Darzacq, X., Tjian, R. A dynamic mode of mitotic bookmarking by transcription factors. eLife. 5, e22280 (2016).
  43. Drosopoulos, W. C., Vierra, D. A., Kenworthy, C. A., Coleman, R. A., Schildkraut, C. L. Dynamic assembly and disassembly of the human DNA polymerase δ holoenzyme on the genome In vivo. Cell Reports. 30 (5), 1329 (2020).
  44. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), New York, N.Y. 819-823 (2013).
  45. Yoshida, S. R., Maity, B. K., Chong, S. Visualizing protein localizations in fixed cells: Caveats and the underlying mechanisms. The Journal of Physical Chemistry B. 127 (19), 4165-4173 (2023).
  46. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  47. Hipp, L., et al. Single-molecule imaging of the transcription factor SRF reveals prolonged chromatin-binding kinetics upon cell stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (3), 880-889 (2019).
  48. Agarwal, H., Reisser, M., Wortmann, C., Gebhardt, J. C. M. Direct observation of cell-cycle-dependent interactions between CTCF and chromatin. Biophysical Journal. 112 (10), 2051-2055 (2017).
  49. Chen, L., Zhang, Z., Han, Q., Maity, B. K., Rodrigues, L., Zboril, E., Adhikari, R., Ko, S. H., Li, X., Yoshida, S. R., Xue, P., Smith, E., Xu, K., Wang, Q., Huang, T. H., Chong, S., Liu, Z. Hormone-induced enhancer assembly requires an optimal level of hormone receptor multivalent interactions. Molecular cell. 83 (19), 3438-3456 (2023).
  50. Garcia, D. A., et al. Power-law behavior of transcription factor dynamics at the single-molecule level implies a continuum affinity model. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6605-6620 (2021).

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Yoshida, S. R., Chong, S. Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates. J. Vis. Exp. (203), e66169, doi:10.3791/66169 (2024).

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