Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fange cytoskjelettbasert agitasjon av musens oocyttkjerne over romlige skalaer

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65976
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1
1Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Collège de France, CNRS, INSERM, Université PSL, 2Department of Developmental and Stem Cell Biology, Institut Pasteur, Université de Paris Cité, CNRS, 3Centre for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology

Summary

Denne protokollen gir et eksperimentelt rammeverk for å dokumentere den fysiske effekten av cytoskjelettet på kjernefysisk form og de indre membranløse organellene i museoocytsystemet. Rammeverket kan tilpasses for bruk i andre celletyper og sammenhenger.

Abstract

En stor utfordring i å forstå årsakene til kvinnelig infertilitet er å belyse mekanismer som styrer utviklingen av kvinnelige kjønnsceller, kalt oocytter. Deres utvikling er preget av cellevekst og påfølgende divisjoner, to kritiske faser som forbereder oocytten for fusjon med sæd for å initiere embryogenese. Under vekst omorganiserer oocytter deres cytoplasma for å plassere kjernen ved cellesenteret, en hendelse som forutsier vellykket oocytutvikling hos mus og mennesker, og dermed deres embryogene potensial. I museoocytter ble denne cytoplasmatiske reorganiseringen vist å være drevet av cytoskelettet, hvis aktivitet genererer mekaniske krefter som agiterer, omplasserer og trenger inn i kjernen. Følgelig justerer denne cytoplasmatiske til nukleoplasmatiske kraftoverføringen dynamikken til kjernefysiske RNA-prosesseringsorganeller kjent som biomolekylære kondensater. Denne protokollen gir et eksperimentelt rammeverk for å dokumentere, med høy temporal oppløsning, virkningen av cytoskelettet på kjernen over romlige skalaer i museoocytter. Den beskriver bildebehandlings- og bildeanalysetrinnene og verktøyene som er nødvendige for å evaluere i) cytoskjelettaktivitet i oocytcytoplasma, ii) cytoskelettbasert agitasjon av oocytkjernen, og iii) dens effekter på biomolekylær kondensatdynamikk i oocytukleoplasma. Utover oocytbiologi kan metodene som er utarbeidet her, tilpasses for bruk i somatiske celler for på samme måte å adressere cytoskjelettbasert tuning av nukleær dynamikk på tvers av skalaer.

Introduction

Kjerneposisjonering er viktig for flere cellulære og utviklingsfunksjoner 1,2,3,4,5. Pattedyrs kvinnelige kimceller kalt oocytter omdanner deres cytoplasma for å plassere kjernen ved cellesenteret til tross for at de gjennomgår en asymmetrisk deling i størrelse, som er avhengig av påfølgende kromosom off-centering6 (figur 1). Denne sentreringen av kjernen forutsier vellykket oocyttutvikling hos mus og mennesker 7,8, og dermed deres embryogene potensial (figur 1).

Cytoplasmatisk remodellering i museoocytter drives primært av aktomyosincytoskjelettet9 (figur 2). Aktiviteten genererer mekaniske krefter som agiterer, flytter og trenger inn i kjernen10 (figur 2). Følgelig justerer denne cytoplasmatisk-til-nukleoplasmatiske kraftoverføringen dynamikken til nukleære messenger RNA-prosesseringsorganeller kalt nukleare flekker11, en av flere membranløse organeller i kjernen kjent som biomolekylære kondensater 12,13,14,15,16 (figur 2).

Live imaging har vært avgjørende for å dechiffrere de funksjonelle implikasjonene av kjernefysisk agitasjon. Filmer av kjernefysisk migrasjon over timer, samt høytidsoppløsningsfilmer av aktinnettet og bulkcytoplasma, bidro i stor grad til utarbeidelsen av en teoretisk modell for kjernefysisk posisjonering, som knytter forskjellige tidsskalaer9. Også filmer med høy temporal oppløsning av cytoplasma, nukleær disposisjon og nukleære komponenter som kromatin og nukleære kondensater, fremhevet rollen som cytoskelettbasert agitasjon av kjernen på RNA-behandling og genuttrykk i museoocytter, som bygger bro over forskjellige spatiotemporale skalaer i cellen10,11. Samlet sett ga en slik skalakryssende tilnærming basert på levende bildebehandling den første begrunnelsen som knytter cytoskeletal agitasjon av kjernen til utviklingssuksessen til oocytter.

Protokollen gir bilde- og bildeanalyserørledningen som brukes til å studere overføringen av cytoplasmatiske krefter (generert primært av F-aktin og delvis av mikrotubuli) til kjernen og dens interne komponenter i museoocytter. Resultatet av disse eksperimentene er å fange kontinuumet av krefter over romlige skalaer, fra cytoskjelettet i cytoplasma til det nukleære interiøret via filmer med høy temporal oppløsning som vist i to nyere studier10,11, som etablerte sammenhengen mellom cytoplasmatiske aktive bevegelser, svingninger i atomomrisset, samt bevegelse og overflatefluktuasjoner av en enkelt type nukleære biomolekylære kondensater: kjernefysiske flekker. Den samme tilnærmingen kan brukes på andre modellsystemer der cytoplasmatiske krefter forventes å endre seg, for eksempel i sammenheng med ondartede kreftceller17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Det europeiske fellesskaps retningslinjer og ble godkjent av det franske landbruksdepartementet (autorisasjon nr. 75-1170) og av Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; GMO-avtalenummer DUO-5291). Mus ble plassert i dyreavdelingen på en 12 timers lys / mørk syklus, med en omgivelsestemperatur på 22-24 ° C og fuktighet på 40% -50%. Mus som brukes her inkluderer kvinnelig OF1 (Oncins France 1, 8 til 12 uker gammel) og hunn C57BL/6 (10 til 14 uker gammel).

1. Oocytsamling og forberedelse

  1. Samle oocytter fra 8 til 14 uker gamle mus som beskrevet i18 og19.
    1. Kort sagt, først ekstrakt eggstokkene fra mus som i18 i forvarmet (37 ° C) M2 + Bovine Serum Albumin (BSA) medium supplert med 1 μM Milrinone19, som forhindrer meiose gjenopptakelse i oocytter.
    2. Punktering eggstokkfollikler med kirurgiske nåler for å frigjøre voksende oocytter fra antralfollikler (slutten av oocyttvekst20).
    3. Samle oocytter av den størrelsen som trengs for eksperimenter (voksende og / eller fullvoksne oocytter) med en mikropipette spesialisert for oocyttsamling, før vask og flytting i retter med ferskt medium under mineralolje.
  2. Mekanisk dissosiere oocytter fra antralfollikulære celler ved å pipettere opp og ned og la stabilisere seg i 1 time i inkubatoren ved 37 ° C før du fortsetter med påfølgende eksperimentelle trinn.
    MERK: Oocytter holdes ved 37 ° C under alle eksperimentelle trinn. For denne protokollen ble de største oocytter, som er de fullvoksne, samlet.

2. Oocyt mikroinjeksjon

MERK: For å fange cytoskjelettbasert aktivitet i cytoplasma, brukes brightfield live-imaging. Mikroinjeksjon av fluorescerende markører er derfor ikke nødvendig, og protokollen kan gjenopptas i trinn 3. For å avbilde atomomrisset ble Rango, en sonde som viste YFP-tag ved N-terminalen og en CFP-tag ved C-terminalen21,22, brukt. Når den avbildes i oocytter ved 488 nm, merker den hele kjernen, bortsett fra nukleolus23, og viser en meget skarp nukleær disposisjon. For å visualisere kjernefysiske flekker ble SRSF2-GFP (NM_011358), en markør for kjernefysiske flekker11, brukt. Det samme mediet brukes til oocyttsamling, mikroinjeksjon, komplementær RNA-oversettelse og levende celleavbildning.

  1. Linearisere Rango-plasmid med SfiI eller SRSF2-GFP-plasmid med AgeI-restriksjonsenzymer.
  2. Syntetiser avkortede komplementære RNA (cRNA) med riktig in vitro transkripsjonssett i henhold til promotoren (T3 for Rango og T7 for SRSF2-GFP) og rens dem ved hjelp av et kolonnerensingssett, som tidligere beskrevet24.
    MERK: Polyadenylat SRSF2-GFP RNA ved hjelp av et polyadenyleringssett for å øke cRNA-stabiliteten. To forskjellige promotorer brukes på grunn av forskjeller i plasmidryggraden.
  3. Mål cRNA-konsentrasjoner ved hjelp av et mikrovolumspektrofotometer.
  4. Fortynn Rango cRNA til 1000 ng / μL og SRSF2-GFP cRNA til 600 ng / μL i dH2O.
  5. Sentrifuge cRNA-alikot ved 4 °C i minst 60 minutter ved 25 000 x g før mikroinjeksjon.
  6. Injiser cRNA som koder for YFP-Rango eller SRSF2-GFP som beskrevet i11,25 inn i cytoplasma av oocytter i 37 ° C M2 + BSA + Milrinone medium ved hjelp av en mikroinjektor.
  7. Inkuber oocytter i minst 2 timer i kulturmedium ved 37 °C for cRNA-oversettelse.
  8. Deponer oocytter i små (5 μL) kulturmediumdråper på en 35 mm vevskulturskål med dekkglassbunn dekket med mineralolje. Plasser en oocyt per dråpe for å unngå fotobleking av nærliggende oocytter.

3. Levende celleavbildning

MERK: Levende musoocytter ble undersøkt med et invertert konfokalmikroskop utstyrt med et Plan-APO 40x/1.25 NA oljenedsenkingsmål, et motorisert skanningsdekk, et inkubasjonskammer (37 ° C), et CCD-kamera koblet til et filterhjul og en spinnskive. Bilder med høy temporal oppløsning hentes ved hjelp av Metamorph (heretter kalt bildebehandlingsprogramvaren) i modus for strømopptak.

  1. Åpne Hent-vinduet i bildebehandlingsprogramvaren.
  2. Sett eksponeringstid til 500 ms, kameraområde på Full Chip og binning på 1.
  3. I kategorien Hent angir du belysning for ønsket kanal. For å avbilde cytoplasmatisk aktivitet, belys oocytter med overført lys. For å avbilde kjernen merket med YFP-Rango eller SRSF2-GFP, belys oocytter med en eksitasjonsbølgelengde på 491 nm.
  4. For cytoplasmatisk omrøring eller YFP-Rango-eksperimenter, fokuser på oocyttnukleolus som lett kan observeres med overført lys (figur 3A). Ett enkelt fly vil bli anskaffet. For kjernefysiske flekkeksperimenter, fokuser på SRSF2-GFP-dråper (figur 3C).
  5. I kategorien Spesiell angir du parametere for å optimalisere anskaffelseshastigheten som nedenfor.
    Kameralukker: Åpen for eksponering
    Clear modus: CLEAR PRESEQUENCE
  6. Åpne Stream Acquisition-vinduet i bildebehandlingsprogramvaren. Angi strømmeparameterne i henhold til eksperimentet. For begge studiene 10,11, bruk parametrene beskrevet nedenfor.
    1. I kategorien Hent angir du følgende parametere.
      Oppkjøpsmodus: Strøm til RAM
      Antall bilder: 480 (kan reduseres til 240 bilder for å redusere bildetiden)
      Kameraparametere: Hent bilder med bildefrekvens
      Antall (Nb) delbilder som skal hoppes over: 0
    2. I kategorien Parametere for digitalkamerakontroller angir du følgende parametere.
      Kameratilstand: HALT
      Lukkermodus: ÅPNE ALDRI
      Clear modus: CLEAR PRESEQUENCE
      Nb av bilder til gjennomsnitt: 1
      MERK 1: Når eksponeringstiden er angitt i strømmodus, bestemmes filmens varighet av antall bilder. For eksempel genererer 500 ms eksponeringstid og 480 bilder en film på 4 minutter. En forhåndsvisning kan vises under bildeopptak.
  7. Juster et interesseområde (ROI) rundt objektet. Minimering av avkastningsområdet reduserer anskaffelsestiden.
  8. Klikk på Oppkjøp i vinduet Stream Acquisition for å starte filmen.
  9. Lagre film som en .tif fil på slutten av anskaffelsen.
    MERK: For å følge kjernefysiske strukturer under filmer med høy temporal oppløsning, bør kjernefysiske sonder (YFP-Rango og SRSF2-GFP) ha et høyt signal-støy-forhold for å lette segmenteringen av objektene under ytterligere trinn med bildeanalyse. Eksogene SRSF2-GFP-ekspresjonsprofiler bør være sammenlignbare med endogene nukleære flekkimmunfarginger (figur 3C-D). Endringer i SRSF2-GFP-ekspresjonsprofiler i forhold til endogen farging kan gjenspeile høye doser cRNA-injeksjon og translasjon26 (figur 3C-D).

4. Bildeanalyse: Cytoplasmatisk omrøring

MERK: Den cytoplasmatiske omrøringen som reflekterer intensiteten av aktinbasert cytoskjelettaktivitet i oocytter, bestemmes av bildekorrelasjonsanalyser ved hjelp av en programvare fra en tidligere publikasjon av laboratoriet9 og tilgjengelig27. Programvaren måler hvor mye pikselintensitet som er bevart mellom påfølgende bilder. Utgangen er tapet av korrelasjon mellom bilder i tid, som starter på 1 og avtar eksponentielt med tiden, som i9.

  1. Juster rå tidsforkortede bilder (Δt = 0.5 s) ved hjelp av Fiji StackReg-plugin (Plugins>StackReg). For å installere pluginet StackReg28, aktiver BIG-EPFL-oppdateringssiden29 for å få tilgang til pluginet.
  2. Beregn bildekorrelasjoner i lys felt i 3 til 4 cytoplasmatiske regioner på ~ 300 μm2 ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Beskjær områdene og lagre dem som separate filmfiler. Åpne terminalvinduet.
    2. Skriv oocyte, trykk på mellomromstasten og trykk deretter Enter. Et vindu som heter Signal og spor vises. Velg de beskårne filmfilene som skal analyseres.
      MERK: Flere filmer kan velges samtidig.
  3. Programmet returnerer filer i samme mappe som filmene. Tre forskjellige filer med .csv, .eps og .xls utvidelser genereres. Den .xls filen inneholder dataene for å tegne korrelasjonsplottene for en region. Gjennomsnittlige korrelasjonsverdier fra forskjellige områder i en celle.
  4. For visuelle klarhetsformål transformerer du endelige korrelasjonsverdier ved å trekke verdien av hvert tidspunkt fra 1 for å få en invertert eksponentielllignende kurve som i 11.

5. Bildeanalyse: Cytoplasmatiske vektorkart

MERK: Museoocytt cytoplasmatiske vektorkart ble generert av Spatiotemporal Image Correlation Spectroscopy (STICS) plugin30 tidligere implementert for å oppdage cytoplasmatiske strømmer i museoocytter31 på Fiji 32 og tilgjengelig på 33. Kartene viser cytoplasmatisk strømningshastighet, størrelse og retning, som i9 og11.

  1. Konverter tidsforkortede bilder med lyse felt (Δt = 0,5 s) til 32-biters format.
  2. Juster bilder med Fiji StackReg-plugin i Plugins > StackReg og velg Rigid Body-transformasjon .
  3. Med plugin-stakken trekker du fra glidende gjennomsnitt jru v2 (i Detrend-verktøy i STICS-plugins-pakken), bli kvitt stasjonære strukturer i filmen ved å trekke fra det gjennomsnittlige bildet av filmen. Avmerkingsboksene Trekk fra statisk gjennomsnitt og Understakk for utdata, velg Oppretthold romlig gjennomsnitt og angi periode til 5.
  4. Tegn en avkastning rundt oocytten, unntatt cortex for å unngå grenseeffekter av pluginet.
  5. Start STICS kart jru V2 plugin (i ICS-verktøy), med underregion størrelse på 32 piksler, trinnstørrelse på 16 piksler, STICS temporal skift av 3, X og Y forskyvninger på 0, hastighet multiplikator på 8, magnitude terskel på 0 og avmerkingsbokser av Normaliser vektor lengde, senter vektorer, utgang hastigheter og bruke filmmaske.
    MERK: Plugin genererer et kart over oocytten i .tif format, som viser cytoplasmatiske strømmer som vektorer med farger som indikerer strømningsamplituder, som i9 og11, og en Excel-fil med målte strømningshastigheter.

6. Bildeanalyse: Nukleære disposisjonssvingninger

MERK: Nukleære disposisjonsfluktuasjoner som reflekterer kjernemembranagitasjon kan bestemmes fra filmer av kjerner merket med YFP-Rango (figur 4A, C). Bildeanalyse for nukleære disposisjonsfluktuasjoner krever Fiji og installasjon av plugins StackReg (aktiver BIG-EPFL-oppdateringssiden29 for å få tilgang til StackReg-plugin), PureDenoise34 og Ovocyte_nucleus. StackReg-pluginet utfører bilderegistrering for å korrigere for mulig global bevegelse. PureDenoise-plugin fjerner støy fra flerdimensjonale bilder som er ødelagt av blandet Poisson-Gauss-støy og jevner ut atomomrisset. Det Ovocyte_nucleus pluginet tersker signalet og fyller hullet som tilsvarer nukleolus for å lage en binær kjernemaske, justere den med StackRreg og beregne avstanden r fra sentroiden til kjernemasken til maskens omkrets for alle θ-vinkler (θ° fra 0° til 360° med 1° trinn), som i figur 4. Alle koder for disse pluginene finner du på 35.

  1. På Fiji, i Plugins > CIRB > Verlhac menyen, velg Ovocyte Nucleus Shape.
  2. Utfør følgende valg i dialogboksen.
    1. Velg mappen som inneholder filmene du vil analysere.
    2. Velg θ-vinkelen (en verdi fra 1° til 360° kan velges og en verdi på 1° ble brukt for optimal disposisjonsoppløsning), marginene for beskjæring (5 μm anbefales for å beholde hele kjernen).
    3. Velg XY-kalibrering og tidsintervall. Klikk på OK.
      MERK: Resultatene vises som .xls filer i en sluttmappe i mappen som inneholder originalfilmene. Denne filen viser alle målte radier r for hver gang t og hver vinkel θ. Et eksempel på utdatafil er gitt i tilleggstabell 1. Sluttmappen inneholder også en film av kjernemasken.
  3. Bruk et regneark til å beregne gjennomsnittlig radius R over alle tidspunktene t for hver definerte θ-vinkel. Dette gjør det mulig å plotte middelformen over tid (figur 4B). Se eksempel i tilleggstabell 2.
  4. For hver t og θ trekkes gjennomsnittlig radius R over tid fra radiusen r. Variansen (r-R)2 er et mål på nukleære konvoluttfluktuasjoner.
  5. Beregn gjennomsnittet av svingningene for alle tidspunkter t og alle vinkler θ for hver kjerne og til slutt for alle kjerner fra en tilstand.
    MERK: Når formen på kjerner er betydelig endret, for eksempel i tilfelle av et forstyrret cytoskjelett, roteres kjerner merket med YFP-Rango på Fiji for å orientere den glatte delen opp og invaginasjonen ned, før du fortsetter med analyse av kjernefysiske disposisjonsfluktuasjoner, som i10.

7. Bildeanalyse: Nukleære flekkbevegelser (diffusiv dynamikk)

MERK: Nukleær flekkbevegelsesanalyse gjør det mulig å utlede typen dynamikk (drevet, diffusiv eller begrenset) av disse organellene fra sporene deres.

  1. Velg strømmodusbilder av oocytter som uttrykker SRSF2-GFP-dråper som primært beveger seg i X-Y-aksen.
  2. Korrekt for bleking av time-lapse-bilder av oocytter som uttrykker SRSF2- GFP ved hjelp av histogramtilpasningsmetoden på Fiji (Bilde > Juster > blekemiddelkorreksjon).
  3. Juster bilder med Fiji StackReg-plugin.
  4. Spor SRSF2-GFP-dråpesentre ved hjelp av Fiji Manual Tracking-plugin (Plugins > Tracking > Manual Tracking). Trykk på Legg til spor for å starte sporing, og trykk på Avslutt spor når du er ferdig. Ikke aktiver sentreringskorreksjon.
  5. Kopier spor til en regnearkfil for å fortsette med tidsmessige beregninger av gjennomsnittlige kvadratforskyvninger (MSD) som i 11, og beregn tidsmessige muskel- og skjelettlidelser fra hver 20 s dråpebane.
  6. Tilpasningskurver (msd(t) = beta x tα) med Nelder-Mead-metoden ved hjelp av R-programvare for å estimere diffusjonseksponenten alfa (α).
  7. Mål den effektive diffusjonskoeffisienten for å kunne sammenlikne de ulike forholdene siden diffusjonen forventes å være uregelmessig (α< 1).
  8. Beregn den effektive diffusjonskoeffisienten Deff fra en lineær tilpasning (alfa = 1) på de 40 første punktene (20 s) av den temporale MSD-kurven og normaliser etter dråpestørrelse (Deff i μm2 / s x 3 / 2 πr i μm).

8. Bildeanalyse: Nukleære flekkoverflatefluktuasjoner

MERK: Nuclear speckle contour evolution in time, en avlesning av aktiv kraftoverføring på disse organellene, ble målt med en spesialbygd plugin Radioak36 for bruk i Fiji og tilgjengelig på37. Plugin trekker ut verdiene av radier av et gitt utvalg for alle vinkler rundt valgsenteret. Formvariasjon over tid ble målt ved å sammenligne verdien av radiusen i forhold til gjennomsnittsverdien for hver vinkel. Plugin gjør det mulig å kvantifisere formfluktuasjonene og tilbyr et alternativ for å visualisere denne dynamikken. For å installere den, last ned Radioak_.jar filen og plasser den i plugins-mappen på Fiji. Start Fiji på nytt. Dette pluginet er en oppdatert versjon av pluginet som brukes til å analysere kjernefysiske disposisjonssvingninger ovenfor og implementere en sammenlignbar rørledning.

  1. I strømfilmer av SRSF2-GFP-dråper, velg større dråper med sammenlignbare størrelser (radius ~ 2,5 μm).
    MERK: Hvis dråpene er for små, vil utilstrekkelig oppløsning føre til avvikende overflatefluktuasjonsmålinger.
  2. Beskjær intervallbilder av dråper som strekker seg over 15 s (Δt = 0,5 s) ved å tegne et rektangel rundt slippverktøyet og velg Bilde > beskjær (figur 5).
  3. Juster bilder med Fiji StackReg-plugin i Plugins > StackReg og velg Rigid Body-transformasjon .
  4. Jevn ut bildet for å fjerne støy rundt dråpen ved å bruke Fiji Smoothen-alternativet under Prosess.
  5. Opprett binær maske av dråpe ved hjelp av alternativet Konverter til maske på Fiji under Behandle > binær. Bruk Standardmetode og Mørk for bakgrunn (figur 5).
  6. Analyser den genererte binære dråpemasken ved hjelp av alternativet Analyser partikler på Fiji under Analyser, velg Fjern resultater og Legg til i lederalternativer og lagre interesseområdet (ROI) i RoiManager (Mer > Lagre) i zip-format som skal leses av Radioak. ROIene må lagres i en mappe som heter konturer i samme mappe med filmene, i filer som heter imagename_UnetCortex.zip for at hver film skal bli funnet av Radioak.
  7. I Fiji Plugins > CIRB > Radioak-menyen , velg enten Get Radii for å behandle bare en film eller Do One Folder for å analysere alle filmene i samme mappe.
    MERK: Et vindu dukker opp for å velge vinkelnummer og skala. Radioak ble skutt opp med 1° vinkeltrinn fra 0° til 360° (inngang på 360) og radiiverdiene ble ekstrahert.
  8. Velg filmen eller mappen som inneholder filmene du vil analysere. Resultatene leveres som .xls filer (én for hver film) i en radioakreskatalog i mappen som inneholder originalfilmene. Hver fil viser alle målte radier r (i μm hvis skalaparameteren ble fylt) for hver gang t (i stykke) og hver vinkel (i radianer; Figur 5; se eksempel på .xls produksjon i tilleggstabell 3).
  9. I regnearket beregner du gjennomsnittlig radius R over alle tidspunktene t for hver definerte vinkel (se eksempel i tilleggstabell 4). Dette gjør det mulig å plotte middelformen over tid.
  10. Plott variansen (r-R)2 i μm2 som tilsvarer målet på dråpeoverflatefluktuasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bildepaneler i figur 3 viser eksempler på en typisk fullvoksen oocytt (figur 3A), nukleoplasma i en fullvoksen oocytt som uttrykker YFP-Rango (figur 3B), nukleoplasmaet i en fullvoksen oocytt som uttrykker en korrekt (venstre panel; Figur 3C) eller et overdreven (høyre panel; Figur 3C) dose SRSF2-GFP cRNA, og en immunfarging av nukleære flekker i en fullvoksen oocytt ved bruk av SC35-antistoffet (figur 3D). Den riktige dosen av SRSF2-GFP cRNA til mikroinjeksjon ble definert basert på visuelle sammenligninger mellom ekspresjonsprofiler av SRSF2-GFP med endogene profiler av nukleære flekker.

Cytoplasmatiske omrøringskrefter i oocytter, som vist ved tidligere arbeid fra laboratoriet ved hjelp av STICS-vektorkart og bildekorrelasjonsanalyse (se9 og11), kan reduseres ved cytoskjelettforstyrrelser, både genetiske (f.eks. FMN2-muterte mus) og kjemiske (f.eks. Cytochalasin D). STICS-kart over kontrolloocytter viser mange vektorer, med farger som indikerer høye strømningshastigheter, mens kart over oocytter med forstyrrede cytoskjelettkrefter viser mindre vektorer, med farger som indikerer lave strømningshastigheter. På samme måte går bildekorrelasjonen veldig fort tapt i kontrolloocytter sammenlignet med oocytter med forstyrrede cytoskjelettkrefter. Dette kan observeres på korrelasjonskurver, med en raskere reduksjon av kurven for kontrolloocytter sammenlignet med oocytter med forstyrrede cytoskjelettkrefter9 eller en raskere økning når kurven er invertert11.

Cytoskjelettkrefter agiterer kjernen og dens indre organeller, spesielt kjernekondensater som kjernefysiske flekker10,11. I figur 4A blir kjernen til kontrolloocytter utsatt for viktige perifere fluktuasjoner, som er synlig ved hjelp av atomsonden YFP-Rango. Kjerneformen i oocytter med forstyrrede cytoskjelettkrefter er stabil over tid (figur 4C). Analyse av nukleære disposisjonsfluktuasjoner er nøkkelen til nøyaktig kvantifisering av agitasjonen. Ved å bestemme variansen av avstanden fra kjernesentroiden til periferien, (r-R)2 (figur 4B), kunne svingninger kvantifiseres, noe som viser at nukleær agitasjon er 6 ganger høyere i kontrolloocytter enn i oocytter med forstyrrede cytoskjelettkrefter10. I figur 5A-B er nukleære flekker (SRSF2-GFP + dråper) vist i kontroll og forstyrrede sammenhenger av cytoplasmatiske krefter ved høy temporal oppløsning. I kontroller svinger dråpeoverflaten betydelig mer enn dråpeoverflater i oocytter med forstyrrede cytoplasmatiske krefter, som kan visualiseres og kvantifiseres ved hjelp av Radioak32-plugin. Visuelt indikerer grønne og røde farger (Radioak-utgang sett på nederste bilder av figur 5A-B) vinkler der pluginet oppdaget overflateendringer mellom påfølgende bilder og hvitt indikerer mangel på overflateendringer.

Figure 1
Figur 1: Illustrasjon av sen oogenese fra mus og tidlig embryogenese. Illustrasjon av kjernesentrering som forekommer i sen oocytvekst, kromosom av sentrering som oppstår under oocyttdeling, og tidlige trinn (1-celle og 2-celle stadier) av embryogenese. De kvinnelige genomene (oocytkjerne og kvinnelig pronucleus) er i rosa, den mannlige pronucleus er i blått. Embryokjernene (etter fusjon av foreldregenomer) er lilla. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Illustrasjon av cytoplasmatisk og kjernefysisk remodellering på tvers av skalaer i voksende museoocytter. Denne figuren oppsummerer sentrale funn fra 9,10,11. Illustrasjon av aktomyosinbasert remodellering av cytoplasma, nukleær agitasjon og funksjonell nukleær biomolekylær kondensatremodellering på tvers av spatiotemporale skalaer. Skala-kryssende remodellering av nukleare flekker forbedrer biomolekylære reaksjoner forbundet med deres funksjon (dvs. spleising av pre-mRNA). Merk at denne protokollen tillater vurdering av kjernefysisk agitasjon bare på tvers av romlige skalaer, men ikke tidsmessige, siden all avbildning gjøres med samme tidsmessige oppløsning på 0,5 s mellom bilderammer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Eksempelbilder av fullvoksen oocytt og nukleoplasma. (A) Lysfeltbilde av en fullvoksen oocytt som viser kromatin (cyan) som omkranser nukleolus. En stiplet hvit sirkel skisserer kjernen. (B) Levende oocytkjerne som uttrykker YFP-Rango; Legg merke til fraværet av fluorescens i nukleolus. (C) Eksempel på levende oocyttkjerne som uttrykker SRSF2-GFP etter mikroinjeksjon av riktige doser cRNA (venstre panel) eller høye doser cRNA (høyre panel); Legg merke til kondenserte (dråpe) og oppløste faser til venstre og deres fravær i tilstanden til høyre. (D) Nukleær flekkimmunfarging i en fast oocyt; Legg merke til den endogene uttrykksprofilen som er sammenlignbar med den i C (venstre panel). Skalastenger = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Plugin-utganger for kontroll og forstyrrede nukleære disposisjonsfluktuasjoner. (A) Time-lapse av en kontrolloocyttkjerne som uttrykker YFP-Rango (øverst) og dens tilsvarende binære maske generert av Ovocyte_nucleus plugin (nederst). (B) Prinsippet om nukleære disposisjonsfluktuasjonsmålinger over tid og i en gitt retning. Retninger er definert av en roterende vinkel θ på 1° trinn fra 0° til 360°. To representative figurer ved t=0 s (gul) og t=135 s (lilla) er representert. Den blå formen tilsvarer gjennomsnittsformen over tid. (C) Nukleære disposisjonsfluktuasjoner av en kjerne i en oocytt med reduserte cytoskjelettkrefter på grunn av forstyrrelse av både F-aktin (FMN2-mutert mus) og mikrotubuli (Nocodazol-behandling; som i10). Skalastenger = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Plugin-utganger for kontroll og forstyrrede dråpeoverflatefluktuasjoner. (A) Beskjæring av en kontroll SRSF2-GFP kjernefysisk dråpe avbildet ved 500 ms per ramme og vist i Ice Look Up Table (LUT) (øverst); binær maske av samme dråpe generert av Fiji (midten); og Radioak plugin-utganger etter analyse av overflatefluktuasjoner i dråpen (nederst), med grønne og røde som indikerer vinkler der pluginet oppdaget overflateendringer mellom påfølgende bilder og hvitt som indikerer mangel på overflateendringer. (B) Overflatefluktuasjoner av en nukleær dråpe i oocytter med reduserte cytoskjelettkrefter på grunn av forstyrrelse av både F-aktin og mikrotubuli (som i11). Skalastenger = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggstabell 1: Eksempel på Ovocyte_nucleus pluginanalyseutgang. Den samme kjernen analysert som den som er vist i figur 4A. Theta (θ) er vinkelen i grader og t1 til t600 tilsvarer rammenummeret, som kan konverteres i tide. Radiene er i μm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 2: Eksempelregneark brukt til å beregne nukleære disposisjonsfluktuasjoner. Den samme kjernen analysert som den som er vist i figur 4A. Theta (θ) er vinkelen i grader og t1 til t600 tilsvarer rammenummeret, som kan konverteres i tide. Tab Raw og gjennomsnitt: Radiene er i μm. Tab r-R: R-R-avstandene er i μm. Tabell (r-R)2: Fluktuasjonsverdiene er i μm2. Tabulatorene x og y tilsvarer de kartesiske koordinatene til radiene fra kategorien Raw og gjennomsnitt. De tillater å tegne kjernens gjennomsnittlige form over tid i middelformfanen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 3: Eksempel på utgang fra Radioak-pluginanalyse. Den samme dråpen analysert som den som er vist i figur 5A. De målte radiene ved forskjellige tidspunkter og vinkler vises. Radiene er i μm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 4: Eksempelregneark brukt til å beregne svingninger i nukleære dråpeoverflater. Den samme dråpen analysert som den som er vist i figur 5A. Theta (θ) er vinkelen i grader og t1 til t600 tilsvarer rammenummeret, som kan konverteres i tide. Tab Raw og gjennomsnitt: Radiene er i μm. Tab r-R: R-R-avstandene er i μm. Tabell (r-R)2: Fluktuasjonsverdiene er i μm2. Tabulatorene x og y tilsvarer de kartesiske koordinatene til radiene fra kategorien Rå og gjennomsnitt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Viktige trinn i denne protokollen inkluderer riktig mikroinjeksjon av oocytter uten å påvirke deres overlevelse eller normal funksjon 9,10,11, samt mikroinjisering av forhåndsdefinerte mengder cRNA som vil tillate korrekt visualisering av relevante strukturer, som nukleare flekker.

Etablering av koblingen mellom cytoplasmatisk og (intra)nukleær dynamikk er viktig når man studerer hvordan cytoskjelettet agiterer kjernen eller dens indre. Denne protokollen, med små modifikasjoner, tillater det ved å korrelere cytoplasmatiske omrøringsintensiteter til kjernefysisk YFP-Rango eller SRSF2-GFP dråpedynamikk (som i11). For å fortsette, bør oocytter først filmes i 120 s i lysfeltmodus for å fange cytoplasmatisk omrøring, før de umiddelbart blir filmet i 120 s med en 491 nm laser for å fange kjernefysisk omriss eller dråpedynamikk. Når det gjelder kjernefysiske SRSF2-GFP-dråper, kan korrelasjonen enkelt vurderes ved å sammenligne deres effektive diffusjonskoeffisienter (se trinn 7 i denne protokollen) med de inverterte maksimale intensitetsverdiene for cytoplasmatisk omrøring oppnådd ved hjelp av bildekorrelasjonsanalyser (se trinn 4 i denne protokollen). Et annet viktig poeng er størrelsen på kondensater som velges for analyser av dråpeoverflatefluktuasjoner. Dråper med tilsvarende diameter bør velges for komparative analyser for å forhindre skjevhet, da størrelsen modulerer intensiteten av overflatefluktuasjoner.

Det er noen begrensninger for denne protokollen. Analyser av nukleære disposisjonsfluktuasjoner er avhengige av full intra-nukleær farging, for eksempel YFP-Rango eller NLS-GFP. For analyser på nukleære flekker kan mikroinjeksjon av store mengder SRSF2-GFP cRNA føre til tilsynelatende endringer i faseseparasjonsegenskapene til denne kondensatmarkøren (figur 3C), som tidligere gjennomgått av andre26. Verifisering av at eksogene proteinuttrykksprofiler er sammenlignbare med de endogene er derfor kritisk. Videre bør relativt små dråper (<2 μm radius) utelukkes fra rørledninger for overflatefluktuasjonsanalyse på grunn av begrensninger i romlig oppløsning med verktøyene som er definert her. Dette oppløsningsproblemet kan vanligvis løses ved bruk av mer resolutive mikroskoper som for eksempel kan være nødvendig for å undersøke overflatefluktuasjoner av mindre kondensater i oocytkjernen eller i den betydelig mindre kjernen til somatiske celler.

Samlet sett tillater denne protokollen fangst av aktin og mikrotubuli cytoskjelettbasert agitasjon av museoocytkjernen på tvers av skalaer. Spesielt tillater det dokumentasjon av cytoskjelettbasert mobilisering av cytoplasma, nukleære disposisjonsfluktuasjoner, sammen med væskelignende nukleære flekkforskyvninger og overflatefluktuasjoner. Selv om noen studier i andre celletyper adresserer noen av disse sakene 38,39,40 via forskjellige protokoller av varierende kompleksitet på individuelle romlige skalaer, gir denne enkle protokollen verktøyene som er nødvendige for å adressere den nevnte cellulære dynamikken over flere skalaer i en enkelt arbeidsrørledning for første gang. Videre muliggjør data generert fra denne tilnærmingen, når de suppleres med biofysisk modellering som i10,11, en minimalt invasiv evaluering av: i) endringer i kjernemekanikk10; ii) overføring av cytoskjelettbaserte aktive krefter i cytoplasma til kondensat i kjernen11; og iii) spredningen av denne aktive energien over forskjellige cellulære rom10,11. Det er viktig at denne protokollen er allsidig, da den kan tilpasses ikke bare til andre kjernefysiske kondensater som nukleolus23, men også til andre celletyper som kreftceller, hvor endringer i både cytoskeletal og nukleær kondensatoppførsel ble dokumentert17,41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

A.A.J. og M.A. skrev manuskriptet sammen, og alle medforfatterne kommenterte manuskriptet. M. A. støttes av CNRS og "Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322).A.A.J. støttes av Fondation des Treilles, Fonds Saint-Michel og Fondation du Collège de France.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A3311
CSU-X1-M1 spinning disk Yokogawa
DMI6000B microscope  Leica
Femtojet microinjector Eppendorf
Fiji
Filter wheel Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish World Precision Instruments FD35-100
Metamorph software  Universal Imaging,  version 7.7.9.0
Mineral oil Sigma Aldrich M8410-1L
NanoDrop 2000  Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice  Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit  Thermo Fisher AM1350
Retiga 3 CCD camera  QImaging
RNAeasy kit  Qiagen 74104
SC35 antibody Abcam ab11826 Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid   OriGene Technologies MG202528 NM_011358
Stripper Micropipette  XLAB Solutions specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine Thermo Fisher AM1384 
T7 mMessage mMachine  Thermo Fisher AM13344
Thermostatic chamber Life Imaging Service
Windows Excel Windows

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Quinlan, M. E. Cytoplasmic Streaming in the Drosophila Oocyte. Annual Rev Cell Developl Biol. 32, 173-195 (2016).
  2. Goldstein, R. E., van de Meent, J. W. A physical perspective on cytoplasmic streaming. Interface Focus. 5 (4), 20150030 (2015).
  3. Gundersen, G. G., Worman, H. J. Nuclear positioning. Cell. 152 (6), 1376-1389 (2013).
  4. Metzger, T. MAP and kinesin-dependent nuclear positioning is required for skeletal muscle function. Nature. 484 (7392), 120-124 (2012).
  5. Roman, W. Muscle repair after physiological damage relies on nuclear migration for cellular reconstruction. Science. 374 (6565), 355-359 (2021).
  6. Almonacid, M., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Control of nucleus positioning in mouse oocytes. Semin Cell Develop Biol. 82, 34-40 (2018).
  7. Brunet, S., Maro, B. Germinal vesicle position and meiotic maturation in mouse oocyte. Reproduction. 133 (6), 1069-1072 (2007).
  8. Levi, M., Ghetler, Y., Shulman, A., Shalgi, R. Morphological and molecular markers are correlated with maturation-competence of human oocytes. Hum Reprod. 28 (9), 2482-2489 (2013).
  9. Almonacid, M., et al. Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nat Cell Biol. 17 (4), 470-479 (2015).
  10. Almonacid, M., et al. Active fluctuations of the nuclear envelope shape the transcriptional dynamics in oocytes. Dev Cell. 51 (2), 145-157 (2019).
  11. Al Jord, A., et al. Cytoplasmic forces functionally reorganize nuclear condensates in oocytes. Nat Commun. 13 (1), 5070 (2022).
  12. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), eaaf4382 (2017).
  13. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev. Mol Cell Biol. 18 (5), 285-298 (2017).
  14. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  15. Gordon, J. M., Phizicky, D. V., Neugebauer, K. M. Nuclear mechanisms of gene expression control: pre-mRNA splicing as a life or death decision. Curr Opin Genet Dev. 67, 67-76 (2021).
  16. Barutcu, A. R. Systematic mapping of nuclear domain-associated transcripts reveals speckles and lamina as hubs of functionally distinct retained introns. Mol Cell. 82 (5), 1035-1052.e9 (2022).
  17. Guo, M. Probing the stochastic, motor-driven properties of the cytoplasm using force spectrum microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
  18. Verlhac, M. H., Kubiak, J. Z., Clarke, H. J., Maro, B. Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes. Development. 120 (4), 1017-1025 (1994).
  19. Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M., Jones, K. T. APCcdh1 activity in mouse oocytes prevents entry into the first meiotic division. Nat Cell Biol. 8 (5), 539-540 (2006).
  20. El-Hayek, S., Clarke, H. J. Control of oocyte growth and development by intercellular communication within the follicular niche. Results Probl Cell Differ. 58, 191-224 (2016).
  21. Dumont, J. A centriole- and RanGTP-independent spindle assembly pathway in meiosis I of vertebrate oocytes. J Cell Biol. 176 (3), 295-305 (2007).
  22. Kaláb, P., Pralle, A., Isacoff, E. Y., Heald, R., Weis, K. Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells. Nature. 440 (7084), 697-701 (2006).
  23. Lafontaine, D. L. J., Riback, J. A., Bascetin, R., Brangwynne, C. P. The nucleolus as a multiphase liquid condensate. Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 165-182 (2021).
  24. Terret, M. E., et al. DOC1R: a MAP kinase substrate that control microtubule organization of metaphase II mouse oocytes. Development. 130 (21), 5169-5177 (2003).
  25. Dumont, J., Verlhac, M. H. Using FRET to study RanGTP gradients in live mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957, 107-120 (2013).
  26. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Gene Develop. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  27. OOCytes. , https://github.com/Carreau/OOCytes (2014).
  28. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  29. ImageJ. , https://imagej.github.io/update-sites/big-epfl (2023).
  30. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys J. 88 (5), 3601-3614 (2005).
  31. Yi, K., et al. Dynamic maintenance of asymmetric meiotic spindle position through Arp2/3-complex-driven cytoplasmic streaming in mouse oocytes. Nat Cell Biol. 13 (10), 1252-1258 (2011).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  33. Stowers ImageJ Plugins. , https://research.stowers.org/imagejplugins/ (2023).
  34. Luisier, F., Vonesch, C., Blu, T., Unser, M. Fast interscale wavelet denoising of Poisson-corrupted images. Signal Process. 90 (2), 415-427 (2010).
  35. Ovocyte_Nucleus. , https://github.com/orion-cirb/Ovocyte_Nucleus (2023).
  36. Letort, G. gletort/ImageJFiles: GLijplugs_v0.2.0. , doi: 10.5281/zenodo.6854802 (2022).
  37. ImageJFiles. , https://github.com/gletort/ImageJFiles/tree/master/radioak (2023).
  38. Chu, F. Y., Haley, S. C., Zidovska, A. On the origin of shape fluctuations of the cell nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (39), 10338-10343 (2017).
  39. Caragine, C. M., Haley, S. C., Zidovska, A. Surface fluctuations and coalescence of nucleolar droplets in the human cell nucleus. Phys Rev Lett. 121 (14), 148101 (2018).
  40. Introini, V., Kidiyoor, G. R., Porcella, G., Cicuta, P., Cosentino Lagomarsino, M. Centripetal nuclear shape fluctuations associate with chromatin condensation in early prophase. Commun Biol. 6 (1), 1-11 (2023).
  41. Boija, A., Klein, I. A., Young, R. A. Biomolecular condensates and cancer. Cancer Cell. 39 (2), 174-192 (2021).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 203
Fange cytoskjelettbasert agitasjon av musens oocyttkjerne over romlige skalaer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Letort, G., Mailly, P., Al Jord, A., … More

Letort, G., Mailly, P., Al Jord, A., Almonacid, M. Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales. J. Vis. Exp. (203), e65976, doi:10.3791/65976 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter