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Analisi del nucleo dell'albero con tomografia computerizzata a raggi X

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65208
Automatic Translation
1, 2,3
1Forest Is Life, TERRA Teaching and Research Centre, Gembloux Agro Bio-Tech, University of Liège, 2UGent-Woodlab, Laboratory of Wood Technology, Department of Environment, Ghent University, 3UGent Centre for X-ray Tomography (UGCT)

Summary

Qui mostriamo come elaborare i nuclei degli alberi con una toolchain di tomografia computerizzata a raggi X. Fatta eccezione per l'estrazione chimica per alcuni scopi, non sono necessari ulteriori trattamenti fisici di laboratorio. La toolchain può essere utilizzata per le stime della biomassa, per ottenere dati MXD/larghezza degli anelli degli alberi e per ottenere dati quantitativi sull'anatomia del legno.

Abstract

Viene presentata una toolchain di tomografia computerizzata a raggi X (CT) per ottenere la larghezza degli anelli degli alberi (TRW), la densità massima del legno tardivo (MXD), altri parametri di densità e i dati quantitativi di anatomia del legno (QWA) senza la necessità di un laborioso trattamento superficiale o di alcuna preparazione fisica del campione. L'attenzione si concentra sui nuclei di incremento e sulle procedure di scansione con risoluzioni che vanno da 60 μm fino a 4 μm. Vengono definite tre scale in cui il legno dovrebbe essere esaminato: (i) scala inter-anello, (ii) scala ad anello, cioè scala di analisi degli anelli degli alberi e densitometria, nonché (iii) scala anatomica, quest'ultima che si avvicina alla qualità convenzionale della sezione sottile. I portacampioni progettati su misura per ciascuna di queste bilance consentono la scansione ad alta produttività di più nuclei di incremento. Una serie di routine software sono state sviluppate specificamente per trattare in modo efficiente le immagini TC tridimensionali a raggi X dei nuclei degli alberi per TRW e densitometria. Questo lavoro spiega brevemente i principi di base della TC, necessari per una corretta comprensione del protocollo. Il protocollo è presentato per alcune specie conosciute che sono comunemente usate in dendrocronologia. La combinazione di stime approssimative della densità, dati TRW e MXD, nonché dati quantitativi di anatomia, ci consente di ampliare e approfondire le analisi attuali per le ricostruzioni climatiche o la risposta degli alberi, nonché di sviluppare ulteriormente il campo della dendroecologia/climatologia e dell'archeologia.

Introduction

La densità del legno èuna variabile 1 facile da misurare che riflette sia le proprietà anatomiche che chimiche del legno2. Nelle stime della biomassa fuori terra, la densità del legno è un'importante variabile di peso 3,4,5, che viene moltiplicata per le dimensioni dell'albero e un fattore che rappresenta il contenuto di carbonio del legno. La densità del legno è strettamente legata alle proprietà meccaniche del legno6 e riflette la storia della vita di un albero7.

La densità della parete cellulare è misurata come circa 1500 kg/m³ ed è considerata abbastanza costante8,tuttavia anche le variazioni di densità della parete cellulare all'interno dell'anello dovrebbero essere considerate 8,9. Le cellule legnose (in generale tracheidi nelle conifere, vasi, parenchima e fibre nei legni duri) sono orientate/modellate in modi diversi e lo spessore della parete cellulare e la dimensione del lume di queste celle variano10. Pertanto, la densità del legno varia tra gli alberi, all'interno di un albero (assiale e trasversale) e entro brevi intervalli all'interno di un anello di un albero11,12. In molti casi la variazione della densità del legno alla scala dell'anello delimita anche il confine dell'anello dell'albero13. La densità del legno e, in ultima analisi, le frazioni tissutali vengono generate e in questo articolo sono ampiamente suddivise in tre categorie (cioè tre diverse scale di risoluzione), a seconda dell'obiettivo dello studio (Figura 1) come descritto di seguito.

Scala inter-anello: Misurando pezzi di legno, si ottiene un unico valore per quel campione. Questo può essere fatto attraverso l'immersione in acqua o geometricamente14. In questo modo è possibile ottenere variabili tecnologiche generali della biomassa o del legno. Per includere la variazione da midollo a corteccia, questi pezzi di legno possono essere ulteriormente suddivisi in blocchi che vengono misurati manualmente per ottenere informazioni sulla strategia del ciclo di vita15. Quando si passa alla TC a raggi X a bassa risoluzione, come negli scanner medici17,18, i dati TRW su anelli medio-larghi possono essere realizzati in modo efficiente su molti campioni 18,19,20. Questa è anche la scala che può essere utilizzata per valutare la biomassa dal midollo alla corteccia di alberi temperati e tropicali 4,22, tipicamente con risoluzioni comprese tra 50 μm e 200 μm.

Scala ad anello: Il legno è un registratore delle condizioni ambientali passate. Il parametro più noto è la larghezza degli anelli degli alberi (TRW), ma per le ricostruzioni della temperatura globale, i record di densità massima del legno tardivo (MXD) si sono dimostrati un proxy migliore per la temperatura22. MXD è una variabile23 facile da misurare e un proxy per lo spessore della parete cellulare e la dimensione delle celle sulle ultime celle di un anello di un albero, e si trova al limite degli alberi e nei siti boreali positivamente collegati alla temperatura dell'aria stagionale24: più calde e lunghe sono le estati, maggiore è la lignificazione della parete cellulare che aumenta così la densità di queste ultime celle. Le misure tradizionali, come l'immersione e la geometria, sono meno accurate per determinare questa densità a livello di anello. Un lavoro precedente ha sviluppato una toolchain per l'utilizzo di pellicole radiografiche su campioni a taglio sottile25. Questo ha innescato una rivoluzione sia nella silvicoltura che nella successiva paleoclimatologia15,18, definendo la massima densità del legno tardivo (MXD), cioè il valore di densità di picco spesso alla fine di un anello, come proxy per la temperatura estiva. Il principio di base è che i campioni vengono segati (da circa 1,2 mm a 7 mm13) per essere perfettamente paralleli alla direzione assiale e il campione viene posto su una pellicola sensibile esposta a una sorgente di raggi X. Quindi queste pellicole radiografiche vengono lette attraverso una sorgente luminosa che rileva l'intensità e salva i profili e i parametri annuali degli anelli degli alberi. Questi strumenti, tuttavia, richiedono una notevole quantità di preparazione del campione e lavoro manuale. Recentemente questo è stato sviluppato per la TC a raggi X in modo più standardizzato o basato su nuclei montati26. La risoluzione varia tra 10 μm e 20 μm. Anche TRW viene misurato su questa scala, soprattutto quando si tratta di anelli più piccoli.

Scala anatomica: A questa scala (risoluzione < 4 μm), i livelli medi di densità diventano meno rilevanti man mano che vengono visualizzate le principali caratteristiche anatomiche e possono essere misurate la loro larghezza e proporzioni. In genere, questo viene fatto attraverso l'esecuzione di microsezioni o scansioni ottiche ad alta risoluzione o scansioni μ-CT. Quando è necessario visualizzare l'ultrastruttura delle pareti cellulari, la microscopia elettronica a scansione è il metodo più comunemente usato27. Su scala anatomica, le singole frazioni di tessuto diventano visibili in modo che i parametri fisiologici possano essere derivati dalle immagini. Sulla base dei singoli parametri anatomici e della densità della parete cellulare del legno, la densità anatomica può essere derivata per il confronto con gli stimatori convenzionali della densità del legno24.

Grazie al miglioramento delle tecniche di sezionamento e al software di immagine29,30, la dendro-anatomia30 è stata sviluppata per avere una registrazione più accurata del legno, sia per avere una stima più precisa dell'MXD nelle conifere che per misurare diverse variabili anatomiche dagli alberi di latifoglie. Su questa scala vengono misurati i parametri anatomici effettivi e messi in relazione con i parametri ambientali31 . Con μCT questo livello può essere ottenuto anche32,33.

Poiché il legno è intrinsecamente igroscopico e anisotropo, la densità del legno deve essere definita con cura e le condizioni di misurazione devono essere specificate, come essiccazione in forno, condizionato (tipicamente al 12% di umidità) o verde (come abbattuto nella foresta)34. Per campioni di grandi dimensioni e per scopi tecnici, la densità del legno è definita come il peso diviso per il suo volume in determinate condizioni. Tuttavia, il valore della densità del legno dipende fortemente dalla scala in cui viene misurata, ad esempio dal midollo alla corteccia la densità del legno può raddoppiare, e su una scala ad anello (nelle conifere) la transizione del legno precoce a quello tardivo si traduce in un aumento significativo anche della densità del legno, con un picco al confine dell'anello.

Qui, viene presentato un protocollo di scansione TC a raggi X di nuclei di incremento per misurare le caratteristiche alle 3 scale sopra indicate (Figura 1). I recenti sviluppi della TC a raggi X possono coprire la maggior parte di queste scale, grazie a una configurazione flessibile. Gli obiettivi della ricerca determineranno l'eventuale protocollo per la scansione.

Un fattore limitante cruciale (che è intrinsecamente collegato alla natura scalata della densità del legno e del legno in generale) è la risoluzione e il tempo necessario per la scansione. Gli esempi dimostrano come: (i) ottenere profili di densità del legno a scala di albero inter-anello per le stime della biomassa in Terminalia superba dal bacino del Congo, (ii) ottenere registrazioni di densità dal cedro di Clanwilliam (Widdringtonia cedarbergensis) sulla base della scansione elicoidale su un sistema HECTOR35 e (iii) misurare i parametri dei vasi su quercia sessile, sul sistema Nanowood. Entrambi gli scanner fanno parte della suite di scanner presso l'UGent Center for X-ray Tomography (UGCT,

Figure 1
Figura 1: Albero decisionale metodologico generale per la scansione TC a raggi X. Le righe indicano i passi da compiere, a partire dall'obiettivo della ricerca fino al formato finale dei dati. Le caselle bianche sono i passaggi rilevanti per questa toolchain. Le caselle in grigio sono passaggi che possono essere eseguiti con altri software o pacchetti R, come dplr47 e Treeclim48 per l'analisi degli anelli degli alberi, e ROXAS44 e ImageJ42 o altre applicazioni (commerciali) per derivare parametri anatomici del legno in base alle immagini TC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ricerca X-CT sul legno
Configurazione di uno scanner: uno scanner CT a raggi X standard è costituito da un tubo a raggi X, un rivelatore di raggi X, uno stadio di rotazione e una serie di motori per spostare avanti e indietro lo stadio di rotazione, e nella maggior parte dei casi anche il rivelatore (Figura 2).

Figure 2
Figura 2. Il sistema di scansione HECTOR. Il sistema35, che mostra la distanza del rivelatore sorgente (SDD) e la distanza dell'oggetto sorgente (SOD). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La maggior parte dei sistemi basati su laboratori ha una geometria a fascio conico, il che significa che i raggi X prodotti vengono distribuiti dalla finestra di uscita del tubo a forma di fascio conico, il che implica che cambiando la distanza tra l'oggetto e il tubo (SOD = Source-Object-Distance) e il rivelatore e il tubo (SDD = Source-Detector-Distance), l'ingrandimento è controllato (vedi la discussione sulla risoluzione). A causa del potere penetrante dei raggi X, passano attraverso l'oggetto e l'intensità del raggio di attenuazione è una funzione dell'energia del fascio di raggi X, della composizione chimica dell'oggetto (il numero atomico degli elementi presenti) e della densità del materiale. Dato uno spettro di energia costante e una composizione costante del materiale del legno, l'attenuazione del fascio di raggi X dipende fortemente dalla densità del materiale, il che spiega il suo utilizzo per la densitometria. L'attenuazione (o trasmissione) può essere espressa dalla legge di Beer-Lambert:

Equation 1

con I0 il fascio di raggi X in arrivo in modo esponenziale, che decade in un fascio di raggi X trasmesso Id quando si propaga attraverso il materiale su una distanza d. Il coefficiente di attenuazione lineare μ dipende da una serie di interazioni con il materiale dell'oggetto. Le proiezioni sono quindi registrazioni del raggio trasmesso.

In pratica, l'oggetto viene montato sullo stadio di rotazione, vengono selezionati un SOD e un SDD adeguati, viene selezionata anche una certa potenza (relativa alle dimensioni, alla densità e alla composizione dell'oggetto) e l'oggetto viene ruotato di 360° e durante tale rotazione vengono effettuate più proiezioni. Queste proiezioni vengono poi utilizzate per ricostruire la struttura interna dell'oggetto. Sono disponibili diversi algoritmi di ricostruzione, di cui i più utilizzati si basano ancora sul framework analitico sviluppato decenni fa, basandosi sulla trasformazione del Radon e sul teorema della fetta di Fourier. Per maggiori dettagli si rimanda alla letteratura specializzata36.

Enigma della risoluzione, del volume dei dati e della dimensione del campione: la risoluzione è fondamentale nella scansione TC a raggi X. Nei sistemi con geometria inversa o con geometria del fascio parallelo come le linee di luce di sincrotrone, altre considerazioni giocano un ruolo. Questo protocollo si occupa solo della scansione TC a raggi X standard da laboratorio con geometria a fascio conico. In questo caso, il concetto di ingrandimento, la dimensione dei pixel del rivelatore e la dimensione dello spot sono essenziali. L'ingrandimento è definito come il rapporto tra SDD/SOD. Inoltre, anche la dimensione dei pixel del rivelatore influisce ovviamente sulla risoluzione: più piccola è la dimensione dei pixel, maggiore è la risoluzione, ma nella maggior parte dei casi il campo visivo (FoV) è anche direttamente correlato alla dimensione dei pixel e alla dimensione del rivelatore (dimensione dei pixel più piccola, FoV più piccolo per lo stesso numero di pixel). Inoltre, anche la dimensione del fascio di raggi X è importante: maggiore è la dimensione del punto, minore è la risoluzione, il che significa che è possibile vedere meno dettagli.

È importante considerare che si potrebbe ottenere una risoluzione superiore a quella possibile secondo i limiti sopra menzionati, quindi è meglio usare il termine dimensione del voxel (un voxel è un pixel di volume) invece di risoluzione. Inoltre, ci sono altri fattori in gioco, come la nitidezza del rivelatore, che limitano ulteriormente la vera risoluzione con cui un oggetto viene scansionato. Solo una vera calibrazione del sistema, utilizzando obiettivi stabiliti, fornisce la risposta veritiera.

Nella maggior parte dei casi, tuttavia, la dimensione del voxel con cui un oggetto può essere scansionato è per lo più limitata dalle dimensioni dell'oggetto. Ciò significa che più grande è l'oggetto, minore sarà la dimensione del voxel. Se l'oggetto non rientra nel FoV del rivelatore per una certa dimensione del voxel, la dimensione del voxel può essere ridotta, ad esempio limitando l'ingrandimento.

Il tempo di scansione e il volume dei dati sono importanti da considerare quando si decide la dimensione del voxel desiderata. In generale, più piccola è la dimensione del voxel e maggiore è il dettaglio che si desidera visualizzare, più piccolo è il campione o meno campioni possono essere scansionati contemporaneamente, più tempo è necessario e maggiori saranno i volumi di dati raccolti. Immaginate il seguente esempio teorico: si può scansionare un campione di 10 cm x 10 cm x 10 cm a 50 μm contemporaneamente con un certo sistema CT a raggi X e si desidera scansionare lo stesso volume a 10 μm, il volume che rientra nel FoV sarebbe solo 2 cm x 2 cm x 2 cm, supponendo che ciò sia fisicamente possibile. Ciò significa che sono necessarie 125 scansioni (5³ = risoluzione 5 volte superiore, scala alla potenza di 3 a causa della natura volumetrica della tecnica di imaging) per coprire l'intero volume e che il volume dei dati aumenterebbe allo stesso modo. Naturalmente, questo è solo un esperimento mentale, e bisogna considerare molto di più della semplice risoluzione. Per ulteriori informazioni, si rimanda il lettore a una panoramica delle possibilità di scansione37.

Flessibilità degli strumenti per la scansione di oggetti in legno: nell'ultimo decennio, molte aziende hanno fornito sistemi CT a raggi X con un assemblaggio simile a quello dell'HECTOR35. Una panoramica di diversi sistemi TC, valutati in particolare per la loro risoluzione temporale, è fornita in38.

Nel complesso, la flessibilità e la facilità d'uso dei sistemi TC a raggi X sono migliorate notevolmente. Molti sistemi consentono la scansione di una vasta gamma di oggetti, come nel caso dei sistemi dell'UGCT. Il protocollo seguente è dimostrato per il sistema HECTOR, che è adatto per l'analisi degli anelli degli alberi. Il protocollo, tuttavia, è valido per qualsiasi altro sistema disponibile se la risoluzione e il formato dei dati lo consentono.

Questi sistemi consentono la scansione di una varietà di oggetti. Nella Figura 3 sono riportate alcune immagini di diversi oggetti in legno scansionati con il sistema HECTOR. È questa flessibilità che comprende le tre scale che presentiamo nella Figura 1, che vanno da una risoluzione grossolana a una risoluzione molto fine.

Figure 3
Figura 3. Esempi di configurazione della scansione. (A) Un tronco, (B) un violoncello49, (C) portacampioni (tipo 1) con nuclei ad albero per la scansione in batch e (D) portacampioni di tipo 2 con nuclei incrementali per la scansione elicoidale montati sullo stadio di rotazione di HECTOR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

1. Campionamento del carotaggio

  1. Assaggia l'albero con una trivella Pressler. Consultare i riferimenti su come carotare manualmente un albero39. Questa toolchain è presentata per anime da 5,15 mm.
  2. Metti i nuclei degli alberi non incollati in cannucce di carta da 6 mm o in qualsiasi altro recettore che non richieda colla. Non incollare i nuclei degli alberi su un supporto di legno. Se le anime erano già montate, smontarle con bisturi/sega o solvente a seconda del tipo di colla.
  3. Evita di avvolgerli in tubi di plastica, cerca di asciugarli prima per evitare la formazione di muffe e carie fungine.
  4. Usa la matita per scrivere sulle cannucce di carta, poiché l'estrazione potrebbe sbiadire le scritte dei pennarelli.
    NOTA: Questa toolchain è adatta anche per anime da 4 mm. È possibile utilizzare anime già montate e levigate, ma queste devono essere prima smontate. Per il legno archeologico o residuo, è necessario creare un campione delle dimensioni di un nucleo (segando/riducendo le dimensioni) per la scansione.

2. Preparazione del nucleo prima della scansione

  1. Eseguire un'estrazione con etanolo/toluene o etanolo o acetone40 Soxhlet per almeno 24 ore (Figura 4A, B). Ciò è necessario per garantire un volume di legno privo di resina per avere un calcolo accurato della densità (la resina attenua il segnale, Figura 4C13,41).
    1. Preparare una soluzione di 1000 mL di etanolo con 427 mL di toluene (secondo ad es. ASTM D 1107 - 96) o etanolo puro o acetone. Molte università hanno un laboratorio di vetro in grado di realizzare una versione adattata dell'apparato Soxhlet per le carote degli alberi (Figura 4B).
    2. Riempire il pallone a fondo tondo con il solvente e mettere i campioni all'interno delle paillettes in un supporto di acciaio inossidabile nell'apparecchio Soxhlet con raffreddatore su un riscaldatore da laboratorio. Consentire almeno 6 sifonatori all'ora.
      NOTA: Per il raffreddamento viene preferibilmente utilizzato un circuito ad acqua chiuso (o qualsiasi altro sistema di raffreddamento moderno). In questo caso, una pompa dell'acqua fa circolare l'acqua, immagazzinata in una bacinella da 100 L con pastiglie di cloro (per evitare lo sviluppo di alghe), a 120 L/h (ma questo dipenderà dalle dimensioni dell'apparato Soxhlet e dal calore applicato dall'elemento termico). Un rinfrescatore d'aria viene utilizzato per raffreddare l'acqua nella vasca da 100 L. Per risparmiare sul solvente, le perle di vetro possono essere utilizzate per riempire il volume vuoto dell'apparato Soxhlet.
    3. Controllare regolarmente la temperatura e il numero di sifonatori. Asciugare le carote sotto una cappa chimica (controllare le politiche di laboratorio per questo) per rimuovere i residui di solvente o mettere un forno di essiccazione sotto la cappa chimica.
  2. Asciugare le carote per 24 ore in un forno di essiccazione (103,5 °C) sotto ventilazione di scarico ed eseguire un bagno di acqua calda (90 °C) o l'estrazione Soxhlet con acqua calda per 24 ore come descritto sopra.
    1. Conservare i campioni nelle cannucce di carta nei portacampioni in acciaio. Asciugare nuovamente in forno asciutto per 24 ore a 103,5 °C, quindi condizionare al 60% di umidità relativa (UR) prima della scansione.
      NOTA: In questo caso si sceglie il valore del 60% perché si tratta approssimativamente delle condizioni medie di umidità relativa ambientale nella sala di scansione TC a raggi X. Possono essere utilizzati anche campioni asciutti in forno. Il fattore più importante è che tutti i campioni vengano scansionati nelle stesse condizioni.
    2. Nel caso in cui l'estrazione dell'acqua degeneri le cannucce di carta, rimettere i nuclei degli alberi in nuove cannucce di carta da 6 mm21. Sia le anime da 5,15 mm che quelle da 4 mm possono essere inserite in cannucce di carta da 6 mm.
    3. Assicurati che l'intera cannuccia di carta sia riempita di legno. Avvolgere entrambe le estremità della cannuccia e tagliare le estremità. Ciò consente un facile inserimento delle cannucce nel supporto cilindrico.
    4. Assicurarsi che il lato del cambio (corteccia) sia chiaramente indicato sul core perché CoreProcessor e RingIndicator presuppongono che il lato della corteccia sia rivolto verso il basso. Rimuovi pezzi e pezzi e nuclei con crepe poiché sono difficili da lavorare.

Figure 4
Figura 4. Flusso di lavoro per l'estrazione e l'essiccazione delle carote prima della scansione. (A) Le carote di accrescimento in cannucce di carta vengono prima messe in un bagno di acqua calda e successivamente in una miscela calda di etanolo e toluene con un apparecchio Soxhlet per 24 ore, quindi asciugate, messe in un bagno di acqua calda per 24 ore, quindi asciugate nuovamente a 103,5 °C, quindi condizionate prima della scansione. (B) Immagini dell'allestimento Soxhlet adattato presso l'Università di Gand. Più apparati Soxhlet adattati sono collegati in serie. Prendere nota del foglio di alluminio e dei tubi isolanti per mantenere il solvente o la miscela di solventi sufficientemente caldo per l'estrazione. (C) Esempio della superficie di un nucleo incrementale da Pinus longaeva prima e dopo l'estrazione. Le resine e gli altri estrattivi mascherano il vero segnale di densità, a causa dell'attenuazione dei raggi X. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Scansione del nucleo

  1. Selezionare il tipo di supporto del campione appropriato (Figura 5) come descritto di seguito, a seconda dello scopo della ricerca come descritto nella Figura 1.
    1. Per la scala inter-anello, utilizzare il supporto di tipo 1 - cartone e schiuma floreale perforata.
    2. Per i dati MXD utilizzare il supporto di tipo 2 - un supporto per campioni in plastica che contiene 6 nuclei di lunghezza compresa tra 1 e 15 cm e ha un diametro di 3 cm.
    3. Utilizzare il supporto di tipo 3 - per scopi dendro-anatomici che consiste semplicemente nel legare insieme cannucce di carta.
  2. Carica i nuclei degli alberi in cannucce di carta nel portacampioni e compila il modello di foglio di calcolo che può essere scaricato su https://dendrochronomics.ugent.be/#software. Ogni numero corrisponde a una determinata posizione nel portacampioni.
  3. Scansione in una struttura μCT a raggi X: consultare un esperto di TC a raggi X per le impostazioni e il protocollo di scansione corretti. Per lo scanner utilizzato in questo protocollo, vedere37.
  4. Ricostruzione delle immagini scansionate: consultare un esperto di TC a raggi X per le impostazioni corrette della ricostruzione o le impostazioni fornite con lo scanner CT (pacchetto software dello scanner CT a raggi X). Per i parametri di ricostruzione per questo protocollo, vedere37.

Figure 5
Figura 5. Tipi di portacampioni e risoluzione. Design dei tre tipi principali di supporto, che corrispondono a (A) scala inter-anello, (B) scala dell'anello dell'albero e (C) scala anatomica. A causa delle dimensioni risultanti, il numero di campioni diminuisce con l'aumentare dei requisiti di risoluzione. I rendering 3D corrispondenti per (D) scala inter-anello (supporto 1), (E) larghezza anello e MXD (supporto tipo 2) e (F) parametri anatomici (supporto tipo 3). Barra della scala = 5 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Ottenere dati TRW, dati di densità e dati anatomici

  1. Iniziare con il software.
    1. Per ottenere i valori di densità (tipo di supporto 1 e 2), installare i seguenti tre pacchetti software: (i) CoreProcessor, (ii) RingIndicator e (iii) CoreComparison toolboxes da
    2. Poiché questi toolbox sono stati realizzati in MATLAB, installa il runtime del compilatore MATLAB (MCR) corretto, disponibile all'indirizzo: http://nl.mathworks.com/products/compiler/mcr/. La versione necessaria attualmente è MATLAB2022B. L'MCR è gratuito, così come i 3 pacchetti software.
    3. Accanto alla cartella dei volumi ricostruiti, crea una nuova cartella vuota per i file MAT (un formato di file di MATLAB che memorizza variabili, ecc.), ad esempio, matfiles_useful_name_sample_holder, questo è necessario per memorizzare i parametri temporanei.
    4. Assicurarsi che il foglio di calcolo si trovi nella cartella dei volumi ricostruiti, in modo da compilare i campioni in un passaggio successivo.
  2. Pre-elaborazione dei volumi principali con CoreProcessor.
    NOTA: Per i dati anatomici ad alta risoluzione, non sono necessarie le seguenti fasi di elaborazione (Figura 1), una volta disponibili i volumi ricostruiti, fare riferimento alle linee guida ImageJ per le immagini 3D42. La segmentazione può essere eseguita tramite il plug-in Weka43 per l'indicazione di recipienti su singole fette, ad esempio12o in plug-in software come ROXAS44.
    1. Preparare l'estrazione del nucleo: Preparare l'estrazione automatica dei nuclei di incremento (a seconda della scala inter-anello Figura 6A o della scala ad anello Figura 6B) come descritto di seguito.
      1. Selezionare la cartella con i file ricostruiti (sezioni TIFF trasversali a 16 bit) e il file del foglio di calcolo (XrayForm.xlsx).
      2. Seleziona la cartella vuota da 4.1.3. Questa è la cartella in cui CoreProcessor creerà un file MAT che verrà utilizzato nella versione 4.2.2. per l'estrazione di nuclei di massa.
      3. Selezionare la cartella del file MAT vuota appena creata o, se non è stata creata, selezionare qualsiasi altra cartella. Il volume è caricato e appare una sezione trasversale longitudinale del cilindro, controllare alcune fette orizzontali per assicurarsi che tutti i nuclei e i riferimenti siano stati montati correttamente nel cilindro.
      4. Fare clic dal basso verso l'alto per selezionare le sezioni da valutare. Queste sezioni trasversali verranno utilizzate per il passaggio successivo, quindi fare clic su tutta la lunghezza. Indicare i riferimenti scuri (aria) e bianchi (Figura 6), tutte le volte indicate nel file del foglio di calcolo. Fare doppio clic dopo ogni selezione.
      5. Per il supporto del campione 1, ispezionare il multischermo con 9 sezioni trasversali, generate attraverso il materiale di riferimento per verificare se il calcolo della densità è stato eseguito sul legno (e non sulla paglia di carta o altro materiale non legnoso). Questo è essenziale per una corretta conversione ai valori effettivi di densità del legno.
      6. In una nuova finestra pop-up, seleziona ogni nucleo separatamente disegnando un cerchio/ellisse attorno ad esso. Eseguire l'etichettatura in base alle informazioni del file del foglio di calcolo, verificare se il nome è corretto. Rispetta l'ordine in cui viene compilato il modello. Tutte le informazioni sono memorizzate in un file MAT, che verrà utilizzato durante il passaggio successivo per estrarre tutti i core contemporaneamente.
    2. Fare clic su Estrazione nucleo di massa per eseguire l'estrazione del nucleo per tutti i nuclei in un determinato cilindro (che sono stati indicati in 4.2.1.2), dato che i metadati e i file del foglio di calcolo si trovano nella stessa cartella.
      NOTA: Quando si utilizza l'estrazione del nucleo di massa, tutti i nuclei verranno estratti in base all'etichettatura dell'utente (che sono memorizzati nella cartella del file mat). Come risultato di questa operazione, verrà creata una nuova cartella denominata Extract che contiene tutti i core separati. Quando nella prima fase vengono preparati più portacampioni e tutti i file MAT vengono memorizzati nella stessa cartella, verranno elaborati tutti i file MAT in questa cartella.
    3. Nella casella degli strumenti CoreProcessor, fare clic su Correzione manuale della Tg, quindi selezionare la cartella Estratto per garantire il corretto orientamento del piano trasversale e radiale di ogni volume del nucleo, in modo simile al montaggio di campioni fisici in un portacampioni prima della levigatura mantenendo il piano trasversale in vista (Figura 7B).
      1. Alcune sezioni trasversali vengono visualizzate in modo che l'utente possa vedere la direzione della fibratura. Nell'ultimo grafico (in basso a destra), ispezionare la fetta presentata e tracciare una linea per indicare la direzione della grana. Fare doppio clic per ruotare automaticamente il nucleo.
      2. Poi appare una schermata, qui ritaglia il volume del nucleo (Figura 7C), facendo in modo che il rettangolo racchiuda l'intero diametro del nucleo. Ciò è necessario perché il punto centrale del rettangolo deve essere il più vicino possibile all'asse centrale (per un corretto allineamento nel modulo RingIndicator).
        NOTA: Se si esegue la scansione ad alta risoluzione, selezionare solo il materiale all'interno del nucleo in questa fase e utilizzare il convertitore per passare al supporto del campione di tipo 2. Questo è certamente utile per le specie ad anello porose, ad esempio.
    4. Eseguire i seguenti passaggi facoltativi in caso di conduttori disallineati, capovolti o rotti o di formati immagine incompatibili.
      1. Correzione dell'inclinazione del nucleo (solo per il portacampione 1): per correggere automaticamente l'inclinazione del nucleo (ad esempio, quando il nucleo è leggermente inclinato nel cilindro; Figura 7A). Questo è importante per i passaggi successivi. Seleziona la cartella estratta creata nel passaggio precedente.
        NOTA: Normalmente non è necessario se si dispone di un portacampioni di tipo 2 o di tipo 3 (Figura 5) o quando tutti i campioni e i portacampioni sono posizionati perfettamente.
      2. Capovolgere i volumi: Nel caso in cui il campione non sia stato posizionato con il lato della corteccia rivolto verso il basso (la direzione del midollo della corteccia non è da sinistra a destra), cambiare la direzione capovolgendo le anime. La funzione richiede una cartella e creerà una nuova cartella.
      3. Incollare anime: cucire virtualmente grandi parti di singole anime. L'idea non è quella di cucire perfettamente, ma di assicurarsi che, se necessario, i singoli conduttori siano nello stesso volume TIFF multipagina. Utilizzare l'indicazione del nucleo rotto (vedere il passaggio 4.3.4.9) per superare gli spazi tra i pezzi del nucleo.
      4. Convertitore: se i volumi sono stati manipolati in un altro pacchetto software e vengono salvati al di fuori della casella degli strumenti (ad esempio, ImageJ), eseguire questo passaggio per ottenere le informazioni corrette dell'intestazione. Utilizzare questo passaggio per i volumi TIFF multipagina a 16 bit provenienti da un altro scanner CT e per l'utilizzo della casella degli strumenti RingIndicator.
        NOTA: Tutti i passaggi da qui sono per le correzioni della direzione della struttura e, infine, la densitometria e l'analisi degli anelli di armatura.
  3. Correzione degli angoli e degli anelli di indicazione in RingIndicator.
    NOTA: Nel modulo RingIndicator è necessario eseguire i seguenti passaggi in ordine cronologico: (i) visualizzazione del piano trasversale e radiale, (ii) correzione della struttura, (iii) creazione del profilo di densità e (iv) indicazione degli anelli manualmente o in modo semiautomatico.
    1. Eseguire la visualizzazione del piano trasversale e radiale come descritto di seguito.
      1. Per familiarizzare con la GUI, aprire la casella degli strumenti e selezionare un file TIFF multipagina (uno che è stato creato dopo l'estrazione e dopo la correzione di tg, quindi dal nome della cartella correzione di Tg).
      2. Selezionare l'opzione Mezzo spessore dell'immagine della sezione per visualizzare un'immagine media delle X sezioni centrali, con X che varia da 1 a 10, dove 1 non rappresenta la media (ovvero visualizza solo la sezione centrale) e 10 è un'immagine media delle 10 sezioni centrali.
        NOTA: La media può essere utile per evidenziare meglio i bordi dell'anello e sopprimere il rumore, d'altra parte può anche rendere i bordi dell'anello meno distinti, soprattutto quando l'angolo della fibra è sostanziale. Si prega di regolare questo valore in base alle esigenze. È importante ricordare che questo è solo per la visualizzazione, non influisce sul volume sottostante, né influisce sugli eventuali calcoli/risultati.
      3. Esaminare l'interfaccia utente grafica (GUI). L'interfaccia grafica contiene una figura superiore con il piano trasversale del nucleo e una figura inferiore con il piano radiale del nucleo e un menu (Figura 8).
      4. Per caricare un nuovo volume principale, cercare la funzione Volume > Carica volume per selezionare un nuovo file TIFF multipagina nella directory. Ora l'utente è pronto per indicare la direzione della struttura per indicare successivamente gli anelli degli alberi effettivi.
    2. Correzione della struttura per facilitare l'indicazione automatica degli anelli degli alberi.
      1. Fare clic manualmente sull'immagine per inserire barre verdi per la correzione della struttura. Inizia con il midollo (o l'anello più vecchio disponibile) e termina con l'anello più recente. Lungo il nucleo correggere le deviazioni strutturali sia sul piano trasversale che su quello radiale.
      2. Assicurati di indicare correttamente l'angolo dell'anello e della fibra, perché tutte le indicazioni successive prenderanno un angolo interpolato tra le rispettive indicazioni.
      3. Inserisci una barra verde su un piano, ne genererà automaticamente una sull'altro piano. Dopo aver inserito la barra, spostare i nodi (quadrati bianchi) all'estremità della barra per modificare l'angolo. Utilizzare il nodo centrale per modificare la posizione della barra. Regola le dimensioni dei nodi per facilitarne l'uso.
      4. Dopo ogni passaggio, assicurati di premere Esporta > dati e Anelli > Esporta anelli, per assicurarti che le indicazioni di anello e fibra siano scritte nei file di .txt corretti. Durante tutte le correzioni, assicurati di eseguire sempre queste due azioni.
    3. Calcolo del profilo di densità.
      1. Utilizzare il grafico Densitometria > Densitometria per calcolare il profilo di densità. Creare e stampare un profilo di densità selezionando Plotto di sovrapposizione > Profilo di densità di stampa, che può fungere da sovrapposizione sui piani del nucleo.
      2. Per il calcolo MXD, indicare una percentuale (consigliata è il 20%, ad esempio, 20% significa che sono inclusi solo il 20% dei valori di densità più alti), per escludere valori più bassi dai condotti in resina, dal legno precoce, ecc. Per i valori di densità media utilizzare 100%. Per la densità minima utilizzare anche il 100%.
    4. Eseguire l'indicazione manuale e/o automatica dei confini dell'anello utilizzando un clic sinistro del mouse per anello, come descritto di seguito.
      NOTA: Inserire le stesse barre verdi del passaggio 4.3.2.1., questa volta l'utente dovrebbe farlo ora squillo per squillo (Figura 9).
      1. Utilizzare Overlay Plotting > Plot Density Profile, per visualizzare il profilo di densità sull'immagine. È meglio indicare il confine dell'anello anche in combinazione con questo profilo.
        NOTA: apri tutte le istanze necessarie dalle caselle degli strumenti, in combinazione con la casella degli strumenti CoreComparison (vedi oltre).
      2. Per le indicazioni automatiche (consigliate ad esempio per le conifere), utilizzare il rilevamento automatico > Max/Min/Inflection . Questa funzione indicherà automaticamente i confini degli anelli degli alberi in base al profilo densitometrico creato nel passaggio precedente. Per le indicazioni automatiche (funziona meglio per le conifere boreali o le specie con confini dell'anello chiari definiti dal profilo di densità), utilizzare il rilevamento automatico > Max/Min/Inflessione . Questa funzione indicherà automaticamente i confini degli anelli degli alberi in base al profilo densitometrico creato nel passaggio precedente.
      3. A seconda della specie (diffusa-porosa/anulare-porosa o conifera), utilizzare il massimo/minimo, o l'inflessione della curva (subito dopo il picco di densità) come criterio di confine dell'anello dell'albero. Il primo parametro è una soglia per la funzione di picco, il secondo è una funzione più fluida.
      4. Dopo aver eseguito le indicazioni dell'anello automatizzate, eseguire lo spostamento automatico (con dimensioni della finestra di 1 pixel e iterazioni definite dall'utente), assicurandosi che non vengano tracciate indicazioni dell'anello l'una sull'altra a causa di questo spostamento ed eseguire nuovamente il grafico densitometrico.
      5. Modificare la data di abbattimento con l'anno in cui sono state prelevate le carote di incremento su alberi vivi o qualsiasi altra data adatta. Il valore predefinito è impostato su 1900.
      6. In Overlay Plotting, selezionare Anelli di stampa per visualizzare gli anni. Selezionare anche il piano su cui tracciare gli anelli e/o il profilo di densità.
      7. Una volta che ci sono due core completamente indicati (ad esempio dallo stesso albero), fai confronti a coppie delle curve di larghezza dell'anello core aprendo la casella degli strumenti CoreComparison. Aprire un'istanza di RingIndicator per ogni core e modificare le indicazioni, se necessario. Esportali di nuovo e utilizza questo approccio iterativo e interattivo per ottenere dati di buona qualità. Nel passaggio successivo (passaggio 4.4.1.), eseguire questa operazione per tutti i core per esportare sia i dati TRW che i valori di densità corrispondenti.
      8. Controllare le posizioni del doppio anello nell'opzione Anelli > Controlla anelli ; Questo controllerà se ci sono indicazioni che hanno una posizione al di fuori delle immagini e anelli che si sovrappongono, ad esempio, nel caso in cui un doppio clic sia avvenuto due volte sulla stessa posizione.
      9. Per i nuclei rotti che hanno pezzi e pezzi, iniziare dal midollo e demarcare le anomalie (aria dovuta a nuclei rotti, punti luminosi dovuti a sacche di resina, contaminazione e parti decomposte) come se fossero anelli per eliminarli in seguito. Terminare con il limite dell'anello dell'albero dell'ultimo anello formato ed esportare i dati. Cercare di evitare la rottura delle carote durante il campionamento (vedere i passaggi 1.1 e39).
        NOTA: È possibile indicare sia gli anelli mancanti che quelli rotti, vedere la Figura 10. Sono definiti due casi, uno in cui il nucleo si rompe nel mezzo di un anello e uno in cui il nucleo si rompe su un bordo dell'anello. Per il primo (Figura 10A), indicare lo spazio, annotare il numero di quello spazio seguito dal numero 1 e chiudere le parentesi. Quindi il programma sommerà le due parti dell'anello per ottenere un valore TRW corretto. Nel secondo caso, viene indicato il numero di gap seguito dal numero 2 e il programma ometterà questa sezione (Figura 10B).
      10. Indicando gli anelli e generando i profili di densità, vengono creati diversi file .txt e memorizzati nella stessa cartella dei file TIFF multipagina, e i più importanti sono elencati nella Tabella 1. Conservare questi file .txt nella stessa cartella delle immagini TIFF, per poterli trattare ulteriormente nel modulo CoreComparison (passaggio 5.4).
        NOTA: per calcolare i valori di densità in modo diverso in base al profilo di densità grezzo (ad esempio larghezza del legno tardivo rispetto alla larghezza del legno precoce45 o altre metriche non supportate dalle caselle degli strumenti CoreComparison e CoreProcessor), utilizzare i file di testo zpos_corr e density_corr e utilizzarli per tali calcoli.
  4. Per confrontare la serie TRW ed esportare i dati tramite CoreComparison , attenersi alla seguente procedura.
    NOTA: Quando si utilizza questa casella degli strumenti, vengono aperte due finestre contemporaneamente, il modulo CoreComparison e il modulo PatternMatching. CoreComparison si occupa della datazione incrociata e dell'esportazione dei dati TRW, mentre il modulo PatternMatching può essere utilizzato per esportare profili di densità e valori di densità (MXD, densità minima (MND), densità media e valori di 4 quartili). L'obiettivo principale di CoreComparison è quello di generare i valori TRW e i valori di densità, e di avere una stima approssimativa della qualità della datazione incrociata, con un accoppiamento a RindIndicator in caso di anelli mancanti o indicazioni errate.
    1. Esegui i seguenti passaggi per la datazione incrociata o l'abbinamento del modello di larghezza dell'anello con altre serie.
      1. Una volta completata la sezione RingIndicator, selezionare i file di testo da confrontare e si aprirà una schermata con le larghezze degli anelli, insieme a datazioni incrociate o parametri statistici come la correlazione di Gleichlaüfigkeit (GLK)46 e/o Spearman tra singole serie (Figura 11).
      2. Per apportare modifiche alle indicazioni degli anelli (ad esempio durante la datazione incrociata), riaprire RingIndicator, importare i dati, esportare i dati e gli anelli modificati e utilizzare il pulsante Aggiorna nel modulo CoreComparison (vedere in alto a sinistra) per visualizzare le modifiche.
      3. Aprire più istanze di RingIndicator per apportare modifiche a diverse serie di anelli degli alberi e utilizzare più monitor dello schermo per eseguire questa operazione.
      4. Nel menu GLK e CORR (Figura 11), eseguire una serie di azioni relative a GLK, come l'assegnazione di soglie alle cifre, l'esportazione dei valori GLK in un foglio di calcolo e la classificazione.
    2. Ottenere i valori TRW da CoreComparison come descritto di seguito.
      1. Utilizzare la funzione di tracciatura ed esportazione in CoreComparison per modificare l'offset tra le curve (un valore maggiore comporta un offset più piccolo). Per visualizzare i dati TRW in un grafico, selezionare Tracciatura ed esportazione > Larghezza anello.
      2. Per esportare i dati TRW, fare clic su Stampa ed esportazione > Esporta dati RW. Esporta le larghezze degli anelli in formato foglio di calcolo o in formato Tucson.
    3. Ottenere i profili di densità dal modulo PatternMatching come descritto di seguito.
      1. Per ottenere i profili di densità nel foglio di calcolo, vai al modulo PatternMatching e, dopo aver caricato i profili, nel menu Altro seleziona Tracciatura > Esporta profili di densità corretti.
      2. Per elaborare in batch i profili o per valutare i dati utilizzando metodi diversi, utilizzare direttamente i file .txt della Tabella 1 (vedere il passaggio 4.3.4.11).
    4. Ottenere MXD, MND e altri valori di densità dal modulo PatternMatching come descritto di seguito.
      1. Per ottenere i dati relativi alla densità media, MXD, MND e quartile per anello dell'albero, utilizzare Altro tracciato > Esporta dati cluster. Verrà generato un foglio di calcolo che si trova nella stessa cartella dei file TIFF.
      2. Le schede del foglio di calcolo sono descritte in dettaglio nella Tabella 2. Esporta queste variabili degli anelli degli alberi su Rstudio o altri software per ulteriori analisi.

Figure 6
Figura 6. Ottenere valori di densità del legno dai valori di grigio. Conversione dei valori di grigio dell'immagine in stime effettive della densità del legno, mediante calibrazione con un materiale di riferimento. (A) Supporto del campione 1, con risoluzione di 60 μm, che mostra il riferimento dell'aria, il riferimento bianco e il nucleo. (B) Sono mostrati anche il supporto del campione, a 20 μm, l'aria, il riferimento e il nucleo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7. Fasi di pre-elaborazione del volume del nucleo 3D. Fasi di pre-elaborazione del volume del nucleo 3D prima della visualizzazione e dell'indicazione degli anelli degli alberi. (A) Correzione dell'inclinazione (assiale), (B) correzione tangenziale, con le barre grigie che indicano la direzione della fibra, (C) il ritaglio del volume del nucleo per ottenere un volume con solo voxel legnosi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8. Screenshot di un core. Schermata di un nucleo (larghezza tangenziale circa 3 mm, risoluzione μm) aperto nella casella degli strumenti RingIndicator. Il riquadro superiore è la vista trasversale, il riquadro inferiore è la vista radiale. Le barre verdi mostrano l'indicazione della struttura (in questo caso sul bordo dell'anello), la linea rossa è il profilo di densità. I numeri gialli indicano l'anno solare e i numeri blu il numero generico dell'anello (contando dalla prima indicazione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9. Indicazione dell'anello e visualizzazione del profilo di densità nel modulo RingIndicator. Le linee verdi sono indicazioni, la linea rossa è il profilo di densità del legno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10. Come affrontare le crepe nei nuclei. (A) Quando si verifica una cricca al centro dell'anello, il numero generico dell'anello (a partire dal midollo) sarà etichettato come uno spazio vuoto e il TRW sarà calcolato sommando le larghezze delle due parti dell'anello. I parametri sono 3 (numero dell'anello) e 1 (caso 1: crepa al centro di un anello)31. (B) Quando si verifica una fessura al limite di un anello, la fessura viene omessa dal calcolo TRW. I parametri sono 3 (numero dell'anello) e 2 (caso 2: crepa al confine dell'anello)31. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 11
Figura 11. Screenshot del modulo Core Comparison. Screenshot del modulo Core Comparison, in cui le serie di larghezze degli anelli sono distribuite verticalmente per un facile confronto visivo. Il riquadro superiore mostra la larghezza dell'anello di 4 nuclei di Fagus sylvatica, il riquadro in basso a sinistra mostra il Gleichlaüfigkeit (GLK) e il riquadro in basso a destra il coefficiente di correlazione di Spearman. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome file Spiegazione
SAMPLENAME_density.txt Valori di densità non corretti per l'intera lunghezza dell'immagine, quindi non corretti per l'angolo dell'anello e della fibra
NOMECAMPIONE _density_corr.txt cf. txt precedente ma poi con valori di densità corretti
NOMEESEMPIO_ring-and-fibre.txt Posizioni e angoli di indicazione dell'anello e della fibra
NOMEESEMPIO_zpos.txt posizione dei confini degli anelli degli alberi sul nucleo, senza correzione dell'anello e delle fibre
NOMEESEMPIO: _zpos.corr.txt idem come ZPOS, ma poi corretto per l'angolo dell'anello e della fibra
NOME CAMPIONE _ringwidth.txt larghezze dell'anello calcolate, considerando l'angolo dell'anello e della fibra

Tabella 1. File di testo generati da RingIndicator. Elenco di file di testo generati dopo l'indicazione degli anelli e l'esportazione del profilo di densità in RingIndicator. Questi devono rimanere nella stessa cartella del file .tiff per poter essere aperti nel modulo CoreComparison.

Variabile dell'anello dell'albero Spiegazione
Densità media Densità media per anello di accrescimento
Densità massima a metà base MXD ma solo in base alla seconda metà dell'anello dell'albero per evitare che i valori di alta densità dell'anno precedente non siano inclusi
Densità minima la densità minima per anello di accrescimento
Q1-Q4 Valori medi e massimi per ciascun quartile del profilo dell'anello intra-annuale

Tabella 2. Dettagli del foglio di calcolo. Le variabili ad anello che vengono esportate in un foglio di calcolo denominato esportano dati raggruppati.

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Representative Results

Se l'obiettivo è la stima della biomassa o l'incremento della crescita degli alberi di molti campioni, ad esempio la scala tra gli anelli (Figura 1), il supporto del campione 1 (Figura 5) viene utilizzato per scansionare i campioni per ottenere profili di densità (vedere il passaggio 5.4.3) e stime della crescita degli alberi, ad esempio per alberi a crescita rapida con TRW di grandi dimensioni, che consente una risoluzione più grossolana. La Figura 12 mostra un esempio dell'andamento della densità assiale e del midollo della corteccia di T. superba, una specie del bacino del Congo. Questi diagrammi si basavano su scansioni di 110 μm da carote di incremento di alberi prese a varie posizioni di altezza nello stelo.

Per la scala ad anello (Figura 1) che viene presa di mira dalla scansione di carote con il supporto del campione 2 (Figura 5B), è possibile l'analisi degli anelli di accrescimento e il calcolo MXD. Un esempio di ciò è la Figura 13, dove viene tracciata una densità minima (in questo caso legata alle precipitazioni della stagione umida) e una cronologia della densità massima per le carote di W. cedarbergensis dalle montagne Cedarberg in Sudafrica26. Questo si basava su nuclei montati a scansione con una risoluzione di 10 μm.

Per la scala anatomica (Figura 1), la scansione di anime con supporto 3, ovvero anime multiple in paillettes di carta avvolte insieme, consente una risoluzione fino a 4 μm. Il risultato è mostrato nella Figura 14, dove viene mostrata una fetta di quercia (Q. robur) con un'immagine TC a raggi X segmentata, con vasi di legno precoce e tardivo segmentati.

Figure 12
Figura 12. Andamento della densità radiale e assiale del legno. (A) Variazione radiale della densità del legno essiccato in forno (kg/m3) da 46 alberi di Terminalia superba del bacino del Congo (RDC; dati estratti da 21), con valori minimi (min), medi e massimi (max), con un profilo grezzo (rosso) sovrapposto. (B) Variazione radiale e variazione assiale da un singolo albero di Terminalia superba , dove ad ogni intervallo di altezza di 1 m è stato prelevato e scansionato un nucleo di incremento (23 nuclei in totale). C'è una tendenza all'aumento della densità dal midollo alla corteccia (evidenziata in base alla barra dei colori) e una maggiore densità del legno nel fusto superiore. Risoluzione di scansione = 110 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 13
Figura 13. Sviluppo cronologico. Una densità minima e una cronologia della densità massima del legno tardivo da Widdringtonia cedarbergensis. Dati estratti da26. La risoluzione di scansione è di 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 14
Figura 14. Scansione ad alta risoluzione di un campione di quercia. Esempio di segmentazione di vasi di quercia su Quercus robur scansionato a 4 μm. La segmentazione è stata eseguita utilizzando il software di analisi Octopus, utilizzando il filtraggio bilaterale, il thresholding, una serie di operazioni binarie di riduzione ed espansione, la trasformata di distanza euclidea e infine l'etichettatura dei vasi. Il colore rappresenta la dimensione del vaso, che va da piccolo (blu scuro) a grande (arancione scuro). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Passaggi critici all'interno del protocollo
I passaggi critici all'interno del protocollo includono la corretta gestione della trivella per ottenere nuclei di incremento di alta qualità (passaggio 1.1. e vedere39) per evitare bit e pezzi. Successivamente, è essenziale che le carote siano lasciate libere (ma vedi26), sia per l'inserimento nel portacampione (Figura 5, vedi21) sia per una corretta estrazione della resina50 e per eventuali analisi future. Subito prima della scansione (passaggio 2.2.2.), il condizionamento dei campioni nella sala scanner è essenziale per evitare deformazioni dimensionali dovute alle fluttuazioni di umidità. Quindi, una volta che gli anelli possono essere indicati nel modulo RingIndicator, è essenziale che i confini e gli angoli dell'anello siano ben indicati, perché i picchi di densità possono appiattirsi, in modo simile alle indicazioni imprecise sui classici sistemi di densitometria13. L'indicazione è importante anche per avere le misure corrette della larghezza dell'anello21. Il passaggio critico successivo è la corretta datazione incrociata tramite il modulo CoreComparison (passaggio 4.4.1.). Se alcuni core hanno indicazioni errate, potrebbe verificarsi una perdita di segnale ambientale51.

Modifiche e risoluzione dei problemi della tecnica
Si noti che le caselle degli strumenti RingIndicator e CoreComparison possono essere utilizzate anche per le immagini flatbed52 dopo aver convertito i dati alla risoluzione corretta nel modulo CoreProcessor. Pertanto, il formato DICOM (formato comune per scopi medici e utilizzato anche per i campioni di legno53) deve essere convertito in .tiff. I reparti che dispongono di scanner CT medicale possono utilizzare questo software solo per il tipo di analisi della scala inter-anello di tipo 1 con risoluzioni di circa 200 μm.

Limiti della tecnica
Lo svantaggio del metodo è che ci sono solo poche strutture disponibili per la scansione della scala degli anelli degli alberi e della scala anatomica (che richiedono una risoluzione più elevata). Il volume e la gestione dei dati possono essere difficili per volumi maggiori54. Per immagini ad altissima risoluzione dell'anatomia del legno (ad esempio, per chiarire ulteriormente le strutture delle fosse, ecc.), fare riferimento alle procedure classiche di utilizzo delle microsezioni per la microscopia a luce trasmessa classica27, la microscopia elettronica a scansione o la microscopia confocale55.

Importanza rispetto ai metodi esistenti
L'utilizzo della toolchain CT a raggi X per i nuclei di incremento qui presentati è stato testato in quanto mostra valori di densità affidabili grazie alla fase di calibrazione (Figura 6)56 e genera valori MXD paragonabili alle procedure di densitometria esistenti13.

Applicazioni future della tecnica
Eventuali applicazioni future della tecnica potrebbero includere l'applicazione del deep learning, tra l'altro per le indicazioni automatizzate degli anelli e le quantificazioni dei tessuti del legno 57, in particolare per le immagini3D.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo i tre revisori anonimi per il loro feedback e suggerimenti. Questa ricerca è stata finanziata dal BOF Special Research Fund for JVdB (BOF Starting Grant BOF. STG.2018.0007.01), per l'UGCT come centro di competenza (BOF. EXP.2017.0007) e come Core Facility (BOF. COR.2022.008), Gli autori ringraziano inoltre la Fondazione per la ricerca delle Fiandre (G019521N e G009720N) e il Fondo per la ricerca industriale UGent (IOF) per il sostegno finanziario all'infrastruttura attraverso la sovvenzione IOF. APP.2021.0005 (progetto FaCT F2021/IOF-Equip/021).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 mm paper straws  http://artstraws.com/education/product/artstraws-thick-asst-cols/ Coring
Aluminium core holders
ASTM standard ASTM D 1107 – 96
Cardboard postal tubes https://www.rajapack.co.uk/envelopes-mailing-bags/postal-tubes/1-5-2mm-brown-cardboard-postal-tubes_PDT05623.html
Column drill
Computer hardware for reconstruction and analysis X-ray CT scanning
Cooling 
Drying oven
Ethanol 
Flask for under soxhlet (2000 ml)
Floral foam https://www.oasisfloral.eu/ Sample holder type 1
Glass beads to fill void volume of Soxhlet to save solvent
Glue
Hot water bath  https://www.memmert.com/products/water-baths/water-bath/#!filters=%7B%7D Soxhlet extraction
Increment borer  https://haglofsweden.com/project/increment-borers/
Plastic cylinder  Moonen et al. 2022  Sample holder type 2
Plastic cylinders
Reservoir
Tailored soxhlet apparatus 
Toluene 
Water pump 
X-ray CT scanner

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Björklund, J., et al. The utility of bulk wood density for tree-ring research. Dendrochronologia. 69 (September), 125880 (2021).
  2. Lachenbruch, B., Mcculloh, K. A. Traits, properties, and performance: How woody plants combine hydraulic and mechanical functions in a cell, tissue, or whole plant. New Phytologist. 204 (4), 747-764 (2014).
  3. Baker, T. R., et al. Variation in wood density determines spatial patterns in Amazonian forest biomass. Global Change Biology. 10 (5), 545-562 (2004).
  4. Bastin, J. F., et al. Wood specific gravity variations and biomass of central African tree species: The simple choice of the outer wood. PLoS ONE. 10 (11), 1-16 (2015).
  5. Chave, J., et al. Improved allometric models to estimate the aboveground biomass of tropical trees. Global Change Biology. 20 (10), 3177-3190 (2014).
  6. Chave, J., et al. Towards a worldwide wood economics spectrum. Ecology letters. 12, 351-366 (2009).
  7. Plourde, B. T., Boukili, V. K., Chazdon, R. L. Radial changes in wood specific gravity of tropical trees: inter- and intraspecific variation during secondary succession. Functional Ecology. 29 (1), 111-120 (2015).
  8. Decoux, V., Varcin, É, Leban, J. -M. Relationships between the intra-ring wood density assessed by X-ray densitometry and optical anatomical measurements in conifers. Consequences for the cell wall apparent density determination. Annals of Forest Science. 61, 251-262 (2004).
  9. Rathgeber, C. B. K., Decoux, V., Leban, J. M. Linking intra-tree-ring wood density variations and tracheid anatomical characteristics in Douglas fir (Pseudotsuga menziesii (Mirb.) Franco). Annals of Forest Science. 63 (7), 699-706 (2006).
  10. Ziemińska, K., Butler, D. W., Gleason, S. M., Wright, I. J., Westoby, M. Fibre wall and lumen fractions drive wood density variation across 24 Australian angiosperms. AoB PLANTS. 5, plt046 (2013).
  11. Ziemińska, K., Westoby, M., Wright, I. J. Broad anatomical variation within a narrow wood density range - A study of twig wood across 69 Australian angiosperms. PLoS ONE. 10 (4), 1-25 (2015).
  12. De Mil, T., et al. Wood density profiles and their corresponding tissue fractions in tropical angiosperm trees. Forests. 9 (12), 763 (2018).
  13. Björklund, J., et al. Scientific Merits and Analytical Challenges of Tree-Ring Densitometry. Reviews of Geophysics. 57 (4), 1224-1264 (2019).
  14. Maniatis, D., Saint André, L., Temmerman, M., Malhi, Y., Beeckman, H. The potential of using xylarium wood samples for wood density calculations: A comparison of approaches for volume measurement. IForest. 4 (1), 150-159 (2011).
  15. Lehnebach, R., et al. Wood density variations of legume trees in French Guiana along the shade tolerance continuum: Heartwood effects on radial patterns and gradients. Forests. 10 (2), 1-22 (2019).
  16. Longuetaud, F., et al. Within-stem maps of wood density and water content for characterization of species: a case study on three hardwood and two softwood species. Annals of Forest Science. 73 (3), 601-614 (2016).
  17. Steffenrem, A., Kvaalen, H., Dalen, K. S., Høibø, O. A. A high-throughput X-ray-based method for measurements of relative wood density from unprepared increment cores from Picea abies. Scandinavian Journal of Forest Research. 29 (5), 506-514 (2014).
  18. Vannoppen, A., et al. Dendrochronologia Using X-ray CT based tree-ring width data for tree growth trend analysis. Dendrochronologia. 44, 66-75 (2017).
  19. Maes, S. L., et al. Evaluating the robustness of three ring-width measurement methods for growth release reconstruction. Dendrochronologia. 46 (May), 67-76 (2017).
  20. Van Den Berge, S., et al. Biomass increment and carbon sequestration in hedgerow-grown trees. Dendrochronologia. 70 (September), 125894 (2021).
  21. De Mil, T., Vannoppen, A., Beeckman, H., Van Acker, J., Van den Bulcke, J. A field-to-desktop toolchain for X-ray CT densitometry enables tree ring analysis. Annals of Botany. 117 (7), 1187-1196 (2016).
  22. St. George, S., Esper, J. Concord and discord among Northern Hemisphere paleotemperature reconstructions from tree rings. Quaternary Science Reviews. 203, 278-281 (2018).
  23. Schweingruber, F., Fritts, H., Braker, O., Drew, L., Schar, E. The X-ray technique as applied to dendroclimatology. Tree-Ring Bulletin. 38, 61-91 (1978).
  24. Björklund, J., et al. Cell size and wall dimensions drive distinct variability of earlywood and latewood density in Northern Hemisphere conifers. New Phytologist. 216 (3), 728-740 (2017).
  25. Polge, H. Applications dans les domaines Technologique et Physiologique. Annales des sciences forestières. 23 (1), 215 (1966).
  26. De Mil, T., et al. A lonely dot on the map: Exploring the climate signal in tree-ring density and stable isotopes of clanwilliam cedar, South Africa. Dendrochronologia. 69 (November 2020), 125879 (2021).
  27. Jansen, S., et al. Preparation of wood specimens for transmitted light microscopy and scanning electron microscopy. Belgian Journal of Botany. 131 (1), 41-49 (1998).
  28. Gärtner, H., Nievergelt, D. The core-microtome: A new tool for surface preparation on cores and time series analysis of varying cell parameters. Dendrochronologia. 28 (2), 85-92 (2010).
  29. von Arx, G., Crivellaro, A., Prendin, A. L., Čufar, K., Carrer, M. Quantitative Wood Anatomy-Practical Guidelines. Frontiers in Plant Science. 7 (June), 781 (2016).
  30. Seftigen, K., et al. Prospects for dendroanatomy in paleoclimatology -- a case study on Picea engelmannii from the Canadian Rockies. Climate of the Past. 18 (5), 1151-1168 (2022).
  31. Castagneri, D., Regev, L., Boaretto, E., Carrer, M. Xylem anatomical traits reveal different strategies of two Mediterranean oaks to cope with drought and warming. Environmental and Experimental Botany. 133 (October), 128-138 (2017).
  32. Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. The New phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
  33. Van den Bulcke, J., et al. X-ray tomography as a tool for detailed anatomical analysis. Annals of Forest Science. 66 (5), 508 (2009).
  34. Williamson, G. B., Wiemann, M. C. Measuring wood specific gravity...Correctly. American journal of botany. 97 (3), 519-524 (2010).
  35. Masschaele, B., et al. HECTOR: A 240kV micro-CT setup optimized for research. Journal of Physics: Conference Series. 463 (1), 012012 (2013).
  36. Kak, A. C., Slaney, M. Principles of Computerized Tomographic Imaging. , Society for Industrial and Applied Mathematics. (2001).
  37. Van Den Bulcke, J., et al. Advanced X-ray CT scanning can boost tree ring research for earth system sciences. Annals of Botany. 124 (5), 837-847 (2019).
  38. Zwanenburg, E. A., Williams, M. A., Warnett, J. M. Review of high-speed imaging with lab-based x-ray computed tomography. Measurement Science and Technology. 33 (1), 012003 (2022).
  39. Gärtner, H., Cherubini, P., Schneider, L., Lucchinetti, S. Advanced Workflow for Taking High-Quality Increment Cores - New Techniques and Devices. JoVE. (193), e64747 (2023).
  40. Schweingruber, F. H., Fritts, H. C., Bräker, O. U. The X-ray technique as applied to dendroclimatology. Tree-Ring Bulletin. 38, (1978).
  41. Grabner, M., Wimmer, R., Gierlinger, N., Evans, R., Downes, G. M. Heartwood extractives in larch and effects on X-ray densitometry. Canadian Journal of Forest Research. 35 (12), 2781-2786 (2005).
  42. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  43. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  44. von Arx, G., Carrer, M. ROXAS - A new tool to build centuries-long tracheid-lumen chronologies in conifers. Dendrochronologia. 32 (3), 290-293 (2014).
  45. Koubaa, A., Zhang, S. Y. T., Makni, S. Defining the transition from earlywood to latewood in black spruce based on intra-ring wood density profiles from X-ray densitometry. Annals of Forest Science. 59 (5-6), 511-518 (2002).
  46. Buras, A., Wilmking, M. Correcting the calculation of Gleichläufigkeit. Dendrochronologia. 34, 29-30 (2015).
  47. Bunn, A. G. Statistical and visual crossdating in R using the dplR library. Dendrochronologia. 28 (4), 251-258 (2010).
  48. Zang, C., Biondi, F. Treeclim: an R package for the numerical calibration of proxy-climate relationships. Ecography. (November 2014), 1-6 (2014).
  49. Van den Bulcke, J., et al. Nondestructive research on wooden musical instruments: From macro- to microscale imaging with lab-based X-ray CT systems. Journal of Cultural Heritage. 27, S78-S87 (2017).
  50. Helama, S., Vartiainen, M., Kolström, T., Meriläinen, J. Dendrochronological investigation of wood extractives. Wood Science and Technology. 44 (2), 335-351 (2010).
  51. Black, B. A., et al. The value of crossdating to retain high-frequency variability, climate signals, and extreme events in environmental proxies. Global Change Biology. 22 (7), 2582-2595 (2016).
  52. Hubau, W., et al. The persistence of carbon in the African forest understory. Nature plants. 5 (2), 133-140 (2019).
  53. Stoffel, M., Klinkmüller, M. 3D analysis of anatomical reactions in conifers after mechanical wounding: First qualitative insights from X-ray computed tomography. Trees - Structure and Function. 27 (6), 1805-1811 (2013).
  54. Van den Bulcke, J., et al. Advanced X-ray CT scanning can boost tree-ring research for earth-system sciences. Annals of Botany. , 1-11 (2019).
  55. Ziaco, E., Biondi, F., Heinrich, I. Wood Cellular Dendroclimatology: Testing New Proxies in Great Basin Bristlecone Pine. Frontiers in Plant Science. 7 (October), 1-13 (2016).
  56. De Ridder, M., et al. High-resolution proxies for wood density variations in Terminalia superba. Annals of botany. 107 (2), 293-302 (2011).
  57. Resente, G., et al. Repeat! Artificial Intelligence for Quantitative Wood Anatomy. Frontiers in Plant Science. 12 (November), 1-14 (2021).

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Analisi del nucleo dell'albero con tomografia computerizzata a raggi X
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De Mil, T., Van den Bulcke, J. Tree Core Analysis with X-ray Computed Tomography. J. Vis. Exp. (199), e65208, doi:10.3791/65208 (2023).

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