Vorbereitung von Drosophila Heart: Eine Technik, um die Herzphysiologie in der Erwachsenenfliege zu studieren

Overview

Dieses Video beschreibt das erwachsene Herz der Fliege, oder auch Drosophila DorsalGefäß genannt. Das vorgestellte Protokoll zeigt ein Sezierverfahren für Lebende Herzpräparate.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Vogler und Ocorr, Visualizing the Beating Heart in Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).

1. Bevor Sie beginnen

1. Frisch vorbereitende künstliche Hämolympierlösung (AH) mit 108mM Na⁺, 5mM K+, 2mM Ca²⁺, 8mM MgCl₂, 1mM NaH₂PO₄, 4mM NaHCO₃, 10mM Ucrose, 5mM trehalose, 5mM HEPES (pH 7.1, alle Reagenzien von Sigma Chemicals). Saccharose und Trehalose sollten dem AH kurz vor dem Einsatz aus gekühlten Stofflösungen hinzugefügt werden, um eine bakterielle Kontamination zu verhindern.
2. AH auf Raumtemperatur bringen und die Lösung durch Luftblasen für mindestens 15 min sauerstoffhaltigen.
3. Ziehen Sie mehrere feine Kapillaren (z.B. Glaskapillaren, 100ul, VWR) für die Fettentfernung erforderlich.

2. Halbintaktes Drosophila-Herz von der Erwachsenenfliege

1. Erwachsene Drosophila Fliegen werden mit Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) für 2-5 Minuten anbeet. Es muss darauf geachtet werden, die Fliegen nicht im Fly Nap für längere Expositionen zu lassen. Kurzfristige Exposition gegenüber Kälte kann auch verwendet werden, um Fliegen zu beästheisieren, aber CO₂ wird nicht empfohlen, da es länger anhaltende Auswirkungen auf Herzfrequenz und Rhythmik hat.
2. Anästhesisierte Fliegen werden, dorsal nach unten, in eine Petrischale gelegt, die mit einer dünnen Schicht Petroleumgelee überzogen ist. Die hydrophobe Nagelhaut in den Flügeln und dem Körper "klebt" reversibel an das Gelee, aber die Fliege kann bei Bedarf neu positioniert werden. Dies wird bei nachfolgenden Manipulationen besonders wichtig.
3. Ein erster Schnitt erfolgt mit einer gebogenen Federschere (Roboz #5611). Die Scherenblätter werden unter den Beinen platziert und zur dorsalen Oberfläche des Thorax in der Nähe des Halses abgewinkelt. Kopf, ventrale Nervenschnur und Beine werden mit einem einzigen Schnitt entfernt. Das Präparat wird dann in eine sauerstoffreiche, künstliche Hämolymphe (AH) eingetaucht.
4. Mit einer Federschere wird die hintere Spitze des Bauches (bestehend aus den Bauchsegmenten 7 und 8) mit einem einzigen Schnitt entfernt. Dies bietet Zugang für seitliche Schnitte an beiden Rändern des Bauches und dient dazu, die Verbindung zwischen dem hinteren Darm und der Bauchhaut zu trennen. Die befreite Klappe der ventralen Bauchhaut wird dann entfernt.
5. In den Schritten 3 und 4 werden die vorderen und hinteren Verbindungen des Darms durchtrennt, so dass die Bauchorgane nur noch von Luftröhren an Ort und Stelle gehalten werden. Der Darm und andere Bauchorgane können in der Regel als eine einzige Masse mit Juwelier Zange (Roboz, #55) und sanftes Ziehen entfernt werden. Das Entfernen der inneren Organe zeigt das schlagende Herzrohr, das noch an der von Fettkörpern umgebenen dorsalen Nagelhaut befestigt ist.
6. Die Fettkörper sind im Lichtmikroskop ziemlich undurchsichtig, daher ist es oft notwendig, einen Teil dieses Fettes zu entfernen, um das Herzrohr deutlich zu sehen. Dies wird durch eine Fettabsaugungstechnik mit fein gezeichneten Glaskapillaren erreicht. Kapillaren werden mit einem Standard-Pipettenzieher (z.B. Sutter P-97 Pipette Puller) hergestellt und dann in Kunststoffschläuche (Tygon, 1/16") eingesetzt, die an einer Vakuumquelle befestigt sind. Dieses System wird verwendet, um überschüssiges Fett aus der Umgebung des Herzschlauchs abzusaugen. Die Saugkraft ist proportional zum Spitzendurchmesser, so dass Pipetten mit Spitzen von mehr als 40 Mikrometern Durchmesser nicht verwendet werden sollten. Es muss äußerste Vorsicht geboten sein, um zu vermeiden, dass das Herz selbst berührt wird und weil der hintere Teil des Herzens sehr zerbrechlich ist, sollte diese Region ganz vermieden werden.
7. Das erwachsene Drosophila Herzrohr ist jetzt exponiert und sollte schlagen. Bei Bedarf können die Nagelhaut und das anhängsige Herz neu positioniert werden, indem die Nagelhaut sanft aus dem Petroleumgelee herausgehoben und vorsichtig wieder nach unten gestampft wird, wodurch wieder ein Kontakt mit dem Herzgewebe vermieden wird. An dieser Stelle sollte die Lösung Baden die Vorbereitung durch frische AHL ersetzt werden. Diese Zubereitung sollte erlaubt sein, für 20-30 Minuten mit Sauerstoffversorgung vor Manipulationen zu gleichgewichtieren. Wenn die Vorbereitung länger als 60 Minuten aufrechterhalten werden soll, sollte sie mit frischer AHL durchdren werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Spring Scissors (curved)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5611	Good for gross cuts (Step 2)
Micro Dissecting Spring Scissors (straight)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5620
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11295-10
Glass Capillaries, fine	Science Products	GB100T8P
Pipette Puller	Sutter Equipment	P-97	Both horizontal and vertical pipette pullers will work
Plastic tubing	Tygon	1/16" inner diameter	for 100 µl capillaries
Histoacryl® tissue adhesive	B. Braun Medical