Summary
Burada, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü sunulmakta olup, ticari satıcılardan araştırma amacıyla temin edilebilen bileşenleri kullanarak vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azaltılmasına neden olmaktadır.
Abstract
Adeno ilişkili viral vektörler (AAV'ler), merkezi sinir sistemini (MSS) araştırmak için dikkate değer bir araçtır. AAV gibi yenilikçi kapsidler. PHP.eB, farelerde intravenöz enjeksiyon ile CNS'nin kapsamlı transdüksiyonunu gösterir. Karşılaştırılabilir transdüksiyon elde etmek için, CNS parankiminde doğrudan enjeksiyona kıyasla 100 kat daha yüksek bir titre (minimum 1 x 1011 genom kopyası / fare) gereklidir. Grubumuzda, AAV dahil olmak üzere AAV üretimi. PHP.eB, yapışık HEK293T hücrelerine ve üçlü transfeksiyon yöntemine dayanır. Yapışık hücrelerle yüksek AAV verimleri elde etmek, emek ve malzeme yoğun bir süreç gerektirir. Bu kısıtlama, konik tüplerde süspansiyon bazlı hücre kültürü için bir protokolün geliştirilmesine yol açtı. Yapışık hücrelerde üretilen AAV'ler, süspansiyon üretim yöntemiyle karşılaştırıldı. Transfeksiyon reaktifleri Polietilenimin veya TransIt kullanılarak süspansiyon halindeki kültür karşılaştırıldı. AAV vektörleri, iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjlemesi ve ardından bir santrifüj filtre kullanılarak tampon değişimi ve konsantrasyonu ile saflaştırıldı. Yapışık yöntemle ortalama 2.6 x 1012 genom kopyası (GC) elde ederken, süspansiyon yöntemi ve Polietilenimin toplamda 7.7 x 1012 GC ve TransIt toplamda 2.4 x 1013 GC verdi. Yapışık olarak üretilen vektörler arasında süspansiyon hücre sistemine göre in vivo transdüksiyon verimliliği açısından bir fark yoktur. Özetle, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü tanıtıldı, bu da vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azalmasına neden olurken, araştırma amacıyla ticari satıcılardan temin edilen bileşenleri kullanarak 3 ila 9 kat daha yüksek verim elde etti.
Introduction
Adeno-ilişkili virüs (AAV) 1965 yılında keşfedildi ve o zamandan beri sayısız uygulamada kullanıldı1. AAV'ler, sinirbilim araştırmalarında gen ve nöronal fonksiyonu incelemek, nörodevreleri haritalamak veya hastalık2 için hayvan modelleri üretmek için uygulanmıştır. Geleneksel olarak, çoğu doğal serotip kan-beyin bariyerini geçmediğinden veya bunu yapmak için yüksek bir doza ihtiyaç duymadığından, bu doğrudan ilgilenilen bölgeye enjekte edilerek yapılır 1,2,3.
AAV'nin keşfi ile. PHP.B4 ve AAV gibi yeni nesil kapsidler. PHP.eB5 ve AAV. CAP-B106, basit bir sistemik enjeksiyon kullanarak merkezi sinir sistemini (CNS) hedeflemek mümkündür. Uzamsal haritalama, AAV tarafından hedeflenen hücreleri ortaya çıkarır. Hücresel düzeydePHP.eB 6,7. Spesifik promotörler/arttırıcılar ile kombinasyon halinde, bu kapsidler, sinirbilimcilerin non-invaziv AAV iletimi ile genleri ve beyin fonksiyonlarını incelemeleri için kapsamlı fırsatlar sunar 4,8.
AAV için daha düşük bir doz gerekirken. PHP.eB (tipik olarak 1 ila 5 x 1011 Genom Kopyası (GC)/fare) AAV9 (4 x 1012 GC/fare)7 ile karşılaştırıldığında, doğrudan enjeksiyon stratejilerine (tipik olarak 1 x 109 GC/μL enjeksiyon) kıyasla daha fazla vektör üretilmesi gerekir. Çoğu doğal serotip, iyodiksanol saflaştırması 9,10,11,12 ile kombinasyon halinde klasik yapışık hücre kültürü sistemi kullanılarak üretilebilir. AAV için. PHP.eB bu, bir deney8 için yeterli vektörleri elde etmek için hücreleri kültürlemek ve transfekte etmek için emek yoğun bir süreç gerektirir. Bu nedenle, konik tüplerde süspansiyon hücre kültüründe AAV üretimi geliştirilmiştir. 300 mL'ye kadar kapasiteye sahip konik borular kompakttır ve hem inkübatör alanından hem de plastikten tasarruf sağlar. Süspansiyon hücrelerinin kültürlenmesi ve büyük miktarlarda işlenmesi, 15 cm'lik plakalar üzerindeki yapışık hücrelere göre çok daha kolaydır. Protokolün transfeksiyon bileşenleri aynı kalır. Bu nedenle, daha önce yapışık sistemle kullanılan plazmitler, süspansiyon hücrelerinde üretime dayalı olarak bu protokolde rahatlıkla kullanılabilir. Protokol, laboratuvardaki diğer araştırmacılara başarıyla aktarıldı ve çeşitli kapsidler ve yapılar için başarıyla kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler, Hollanda Kraliyet Bilimler Akademisi'nin (KNAW) kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylandı ve AVD8010020199126 numaralı proje kapsamında Hollanda Hayvan Deneyleri Yasası'na uygundu. Şekil 1'de, protokolün tamamına şematik bir genel bakış sağlanmıştır. Tohumlama hücrelerinden AAV saflaştırmasına kadar, protokolün tamamlanması 6 gün sürer.
1. Reaktif hazırlama
- Plazmit saflaştırma
- Plazmitlerin sterilitesini sağlamak için birkaç ayarlama ile üretici tarafından tarif edildiği gibi plazmit ekstraksiyonu gerçekleştirin.
- Steril damıtılmış su ve mutlak etanol kullanarak% 70 etanol hazırlayın.
- İzopropanol santrifüj adımından sonra, akış kabini davlumbazındaki plazmitleri kurutun ve tüplere steril %70 etanol ekleyin. Etanol çökeltildikten sonra, plazmitleri akış kabini davlumbazında kurutun ve plazmiti steril damıtılmış suda yeniden süspanse edin. Sterilize edilmiş mikrosantrifüj tüpleri kullanmaya özen gösterin.
- Niceleme, kısıtlama analizi ve gerekirse sıralama için bir alikot alın. Mutasyonların verim üzerinde olumsuz bir etkisi olabileceğinden, ters çevrilmiş terminal tekrarlarının (ITR'ler) bütünlüğünün kontrol edilmesi tavsiye edilir. Numune konsantrasyonunu 1 μg/μL'ye ayarlayın.
- 10x Tween lizis tamponunun hazırlanması
- 30.3 g Tris tamponu ve 2.033 g MgCl2.6H 2O'yu 400mL steril damıtılmış suda çözün, pH'ı 8.0'a ayarlayın ve toplam hacmi 450 mL'ye yükseltin.
- Tween 20'yi steril tutun, davlumbazdaki tampon solüsyona 50 mL Tween 20 ekleyin ve 0,2 μM vakum filtresi kullanarak filtre sterilizasyonu yapın.
- İodiksanol dilüsyonları
- İodiksanol çözeltisi% 60 konsantrasyonda sağlanır. %15, %25 ve %40 çözümler yapmak için başlangıç çözümünü kullanın.
- % 15'lik çözelti için, 60 mL% 60'lık çözeltiyi 48 mL 5 M NaCl ve 48 mL PBS-MK (5 mM MgCl2 ve 12.5 mM KCl ile 5x PBS) ile seyreltin ve 240 mL'ye kadar damıtılmış su ekleyin.
- % 25 çözelti için, 67 mL% 60 çözelti ve 32 mL PBS-MK seyreltin. 160 mL'ye kadar damıtılmış su ekleyin. İyice karıştırın ve 1.6 mL fenol kırmızısı çözeltisi ekleyin.
- % 40'lık çözelti için, 160 mL% 60'lık çözeltiyi 48 mL PBS-MK ile seyreltin ve 240 mL'ye kadar damıtılmış su ekleyin. % 60 çözelti için, 100 mL % 60 çözeltiye 1 mL fenol kırmızısı ekleyin.
- PBS %5 sükroz çözeltisi
- Kalsiyum veya magnezyum içermeyen 500 mL'lik bir DPBS şişesine 25 g sükroz ekleyin. İyice çalkalayın ve 0,2 μM şişe vakum filtresi kullanarak filtreleyin.
- Polietilen glikol (PEG) 8000 çözeltisi
- 400 g PEG 8000 ve 24 g NaCl'yi steril damıtılmış suda çözün ve 1000 mL'lik bir nihai hacme ayarlayın. Tamamen eriyene kadar ısıtarak karıştırın. pH kağıdı kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın.
- Filtre, %40 PEG 8000 çözeltisi elde etmek için 0,2 μM şişe vakum filtresi kullanarak sterilize edilir. Çözelti deposunun 4 °C'deki viskozitesi nedeniyle filtrelemenin biraz zaman alacağını unutmayın.
2. HEK293 süspansiyon hücrelerinin kültürü
- Temizlik için %70 etanole batırılmış mendiller kullanın. Biyogüvenlik kapağını temizleyin, hücrelerin kültürlenmesi için gerekli tüm malzemeleri hazırlayın ve temizleyin.
- 50 mL'lik bir konik kültür tüpünde 30 mL süspansiyon hücresi ortamını 37 °C'ye kadar önceden ısıtın. Viral üretim hücrelerini sıvı nitrojenden alın. Hücreleri 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çözdürün. Flakon tamamen çözülmeden hemen önce, %70 etanole batırılmış bir mendille temizleyin ve flakonu biyogüvenlik başlığına aktarın.
NOT: Burada kullanılan viral üretim hücrelerinin detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir. - Hücreleri önceden ısıtılmış 50 mL'lik konik kültür tüpüne hızlı bir şekilde aktarın. 37 °C, %80 nem, %8 CO2, dakikada 200 devir (RPM) ve 50 mm çalkalama çapı olan çalkalama inkübatörlerinde kültür hücreleri. Geçiş hücreleri, canlılık% 90'ın üzerinde olduğunda ve hücre yoğunluğu 1-3 x 106 hücre / mL'nin üzerinde olduğunda.
NOT: Kullanılan inkübatörün çalkalama çapı 50 mm'dir; Kültür koşulları, farklı bir çalkalama çapı için ayarlanmalıdır. - Çözüldükten 3-4 gün sonra geçiş hücreleri. Kontaminasyon belirtisi olmadığından emin olmak için kültür tüplerini kontrol edin; Örneğin, mantar renksiz (siyah veya yeşil) bir halka olarak görünecektir.
- 1 mL'lik bir şerit kullanarak numune başına 400 μL %0.4 tripan mavisi çözeltisi hazırlayın.
- Süspansiyon hücrelerini inkübatörden hızlı bir şekilde alın. Hemen 1 mL'lik bir şerit kullanarak tüpten 500 μL çıkarın. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Hazırlanan tripan mavisi tüpe 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Karıştırmak için tüpü yavaşça ters çevirin; Hücre ölümüne yol açacağından karıştırmak için pipet yapmayın. Hücreleri inkübatöre geri döndürün.
- 50 μL tripan mavisi ile muamele edilmiş hücre süspansiyonu alın ve hemositometre lamına uygulayın. Toplam canlı hücreleri sayın ve ertesi gün geçiş veya transfeksiyon için gereken hücre süspansiyonu ve ortam miktarını hesaplayın.
- İnkübatörde 10-15 dakika ılık ortam. Isıtılmış ortama hücre süspansiyonu ekleyin ve inkübatöre geri dönün. 3 gün boyunca (yani Pazartesi-Perşembe) hücreleri geçirmek için 0,5 x 106 hücre/mL olarak ayarlayın; 4 gün boyunca (yani Perşembe-Pazartesi) hücreleri geçirmek için 0,3 x 106 hücre/mL olarak ayarlayın.
NOT: Üreticiye göre, viral üretim hücreleri her 26 saatte bir ikiye katlanır ve geçmeden önce 3,5 x 106 ile 5,5 x 106 arasında olmalıdır. Hücreler 20. geçişe kadar saklanabilir.
3. Transfeksiyon
- 1. Gün
- Transfeksiyondan 24 saat önce, 300 mL ortamda / mL başına 1 x 106 hücre kültürleyin.
- 2. Gün
- Sıcak ortam, plazmitler ve transfeksiyon reaktifi oda sıcaklığına. Hazırlanacak miktarlar için Tablo 1'e bakınız.
- Kısaca plazmitleri ve reaktifleri girdaplayın. Hazırlanan ortama, girdaba plazmitler ekleyin. Transfeksiyon reaktifi ekleyin ve kısaca girdap yapın. Bu adımdan sonra karışımı çalkalamayın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Bu arada, 1. günde hazırlanan hücreleri sayın. Hücreler mL başına 2 ila 2,5 x 106 hücre arasında olmalı ve > %95 canlı olmalıdır.
- İnkübasyondan sonra, damla damla transfeksiyon karışımını tüpleri hafifçe döndürürken hücrelere ekleyin. 72-96 saat inkübe edin.
4. Hücrelerin toplanması
- 5. Gün
- 33 mL 10x hücre lizis tamponu (500 mM Tris pH 8,% 10 Tween 20, 20 mM MgCl2) ekleyin, hafifçe çalkalayarak karıştırın ve 37 ° C'de 1.5 saat çalkalayarak inkübe edin.
- 3428 x g'da 4 °C'de 60 dakika santrifüjleyin. Hücre lizatını berraklaştırmak için 0.45 μM PES vakum filtresinden süzün ve arıtılmış lizatı filtrenin kabında bırakın.
NOT: Filtrasyondan sonra isteğe bağlı: kantitatif PCR (Q-PCR) için 50 μL numune alın. - 360 mL filtrelenmiş hücre lizatına 90 mL %40 PEG 8000 çözeltisi ekleyin.
- Karıştırma çubuğunu %70 etanol ile temizleyin ve numuneye ekleyin. Buz üzerinde veya soğuk odada 300 RPM'de 1 saat karıştırın. Gece boyunca karıştırmadan 4 °C'de inkübe edin.
NOT: 1 saat ila 72 saat arasındaki inkübasyon süreleri test edilmiştir. Daha uzun inkübasyon süreleri, genel protein çökelmesi üzerinde olumsuz bir etkiye sahiptir.
5. İodiksanol saflaştırma
- 6. Gün
- PEG çökeltilmiş kültür hacmi numunesinin tamamını temiz, büyük bir konik tüpe aktarın ve 2820 x g ve 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve PEG peletini kalsiyum ve magnezyum ile 15 mL DPBS'de yeniden süspanse edin. Peletin yeniden askıya alınması zordur; Bunu dikkatli bir şekilde yapmak için zaman ayırın.
- Yeniden askıya alınan parçayı 50 mL'lik temiz bir tüpe aktarın. PEG, biyoreaktör tüpünün yanlarında kalacaktır. Tüm PEG çökeltisini toplamaya dikkat ederek fazladan 10 mL ekleyin. Toplam 25-30 mL hacim için hepsini 50 mL'lik bir kaba aktarın.
- 40 μL DNaseI (10 U/μL) ekleyin. 1 saat 37°C'de inkübatöre koyun.
NOT: DNaz inkübasyonundan sonra isteğe bağlı: Q-PCR için 50 μL numune alın. - PEG çökeltme için kullanılan karıştırma çubuklarını klorür çözeltisi ve ardından %70 etanol ile iyice temizleyin. Bir sonraki deney için karıştırma çubuklarını %70 etanol içinde bırakın.
- 25 mm x 89 mm'lik bir poliallomer tüpü, her tüpte 15,5 mL konsantre hücre lizatı içeren bir cam Pasteur pipeti kullanarak doldurun. Hücre lizatı ekledikten sonra, cam Pasteur pipetini yenisiyle değiştirin.
- % 15 -% 60 arasında iyodiksanol çözeltileri ekleyin:% 15 iyodiksanol çözeltisinin 9 mL'sini hücre lizatının altına hafifçe infüze edin. Daha sonra, %25 ve %40 iyodiksanol çözeltilerinden 5 mL ekleyin ve son olarak, %60 iyodiksanol çözeltisinden 5 mL ekleyin.
- İodiksanol katmanlarını rahatsız etmemeye dikkat ederek hava kabarcıklarının çoğunu gidermek için DPBS +/+ içeren bir şırınga kullanarak tüpü doldurun. Bir elektrik tüpü kabı kullanarak tüpü kapatın.
- Bir ultrasantrifüjde 16 °C'de 490.000 x g'de 1 saat 10 dakika boyunca sallanmayan bir rotorda santrifüjleyin. Ultrasantrifüjden çıkarın, tüpleri metal bir tokada birleştirin ve toplama tüplerini hazırlayın. Eğirme sırasında dökülme ihtimaline karşı davlumbazdaki rotoru açın.
- Bir adet 50 mL'lik tüp (rotor tüpünü atmak için), bir adet 15 mL'lik tüp (virüs toplamak için), 5 mL'lik bir şırınga ve gradyan başına 30G ve 19G'lik bir iğne hazırlayın.
- 30G'lik bir iğne ile tüpün üst kısmında bir delik açın. İğneyi yerinde bırakın. Şırınganın üzerine 19G'lik bir iğne yerleştirin.
- Tüpü, fenol kırmızı göstergesi ile görülebilen %40/%60 arayüzünün hemen altında dikkatlice delin. İğne eğiminin %40'lık katmana baktığından emin olun.
- Baskın olmayan elinizi kullanarak 30G iğnesini tüpün üstünden çıkarın. İğne eğimliyken, virüsü / iyodiksanol'ü yavaşça çıkarın. Amaç 3 mL ile 4.5 mL arasında ekstrakte etmektir. Yaklaşık yarısına kadar ve %40/berrak tabakanın içine, eğimin aşağı bakması için iğneyi döndürün ve protein tabakasından toplanmayı önlemek için çıkarmaya devam edin.
- 50 mL'lik tüpü baskın olmayan elinizle hazırlayın, tüpü 50 mL'lik tüpe yerleştirirken iğneyi dikkatlice çıkarın ve atın. AAV / iyodiksanol süspansiyonunu DPBS'de 5 mL'ye kadar doldurarak 15x seyreltin.
- Bir santrifüj filtre tüpüne aktarın ve 3428 x g, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Akışı atın; Filtrenin tutucusunu yavaşça çıkarın ve alt kabı bir atık şişesine koyun. Filtrelemek ve yeniden süspanse etmek için 15 mL PBS-%5 sükroz ekleyin.
- 3428 x g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin. Arabellek değişimini en az 3 kez tekrarlayın. Virüsü (~150-250 μL) 4 °C'de (PHP. B varyantları maksimum 3 ay) veya alikot 50 μL alikotlar halinde ve uzun süre -80 ° C'de saklayın.
BILGINIZE: PHP. B kapsid varyantları donmaya/çözülmeye karşı hassastır, bu nedenle bundan kaçınılmalıdır. - Titrasyonu önceki protokol10'da açıklandığı gibi gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çoğu akademik laboratuvar, AAV üretimi için yapışık HEK293T hücreleri kullanır 8,9. Bu, doğrudan enjeksiyon için küçük miktarlarda AAV gerektiğinde nispeten iyi çalışsa da, AAV gibi sistemik kapsidlerle benzer transdüksiyon elde etmek için 100 kat daha yüksek bir titre (minimum 1 x 1011 GC / fare) gereklidir. PHP.eB (İngilizce).
Bu protokolde, konik tüplerde kültüre edilen süspansiyon HEK293 hücreleri kullanılarak AAV üretimi kurulmuştur. Küçük ölçekli kültürler 50 mL'lik tüplerde ve büyük ölçekli 600 mL'lik tüplerde yapılabilir. Belirli çalkalayıcılar için (Malzeme Tablosuna bakınız), aynı anda 16 adede kadar büyük tüpün kültürlenebildiği bir raf kullanılabilir. Bu raf, 50 mL'lik tüpler için özel kesici uçlarla birlikte kullanılır (Şekil 2A). Bu sistem, bu protokolün kültürleme ve transfeksiyon segmenti için önemli bir zaman kazancı sunar. Üretimin ilk kurulumu, lusiferaz ve yeşil floresan proteini (GFP) için raportör yapılarla yapıldı10,11. Buna paralel olarak, GFP yapısı, daha önce yayınlanmış bir protokol12'de açıklandığı gibi 12, 15cm2'lik plakalar halinde üretildi. Ortalama olarak, polietilenimin (PEI) kullanılarak toplam 7.7 x 1012 GC ve TransIt kullanılarak 2.4 x 1013 GC verim elde edildi (Şekil 2B). PEI için bu neredeyse 3 kat bir gelişmedir; TransIt için, yapışık kültürle (2,6 x 1012) elde edilen titrelere göre 9,2 kat iyileştirmedir. Süspansiyon hücrelerini transfekte etmek için kullanıldığında, TransIt, PEI'ye kıyasla verimde yaklaşık 3 kat iyileşme sağlar (Şekil 2B).
Daha sonra, AAV vektörlerinin performansı in vivo olarak test edildi. GFP vektörleri PEI ve TransIt ile üretildi ve klasik aderasyon sistemi ile üretilen GFP vektörleri ile karşılaştırıldı. Enjeksiyondan 4 hafta sonra fareler (20-25 g ağırlığında 6 hafta C57BL / 6 dişi fare) sakrifiye edildi ve fare beyinlerindeki GFP ekspresyonu histoloji ile değerlendirildi (Şekil 3A). Sagital beyin kesitleri üzerinde karşılaştırmalı analiz yapıldı. Bu üretim yöntemleri kullanılarak üretilen virüsün iletim modelinde herhangi bir fark gözlenmemiştir (Şekil 3B). Her iki yöntem kullanılarak üretilen vektörlerin lusiferaz aktivitesi de değerlendirildi. Transdüksiyon 3 hafta boyunca in vivo olarak ölçüldü; zaman içindeki ekspresyon modeli, hangi transfeksiyon reaktifi kullanılırsa kullanılsın benzerdir (Şekil 4).
Daha sonra, protokol ekibin diğer üyeleri tarafından test edildi ve uygulandı (Tablo 2). PEI ile diğer kapsidlerin üretimi başarılı oldu ve ortalama 3.5 x 1012 GC vektör verimi verdi. Kapsid B10 üretimi için, PEI'ye karşı TransIt kullanılarak 3 kat iyileştirme sağlanabilir. Başka bir proje için, AAv.PHP.eB'de paketlenmiş birkaç yapı, fare başına 5 x 1011 GC'lik bir dozda intravenöz olarak 7 fareye enjekte etmek için yeterli olan ortalama 3.7 x 1012 verim verdi. Bu sonuçlar, protokolün çeşitli kapsidler ve yapı kombinasyonları için birkaç araştırmacı tarafından başarıyla kullanılabileceğini göstermektedir.
Şekil 1: Üretime şematik genel bakış. 1. günde (D1), hücreler 300 mL'lik tüplerde kültürlenir. 2. günde (D2), hücreler ilgili plazmitlerle transfekte edilir. 5. günde (D5), hücreler toplanır ve 10x ara lizis tamponu kullanılarak parçalanır. Lizizden sonra, hücre artıkları santrifüjleme ile uzaklaştırılır. Daha sonra, hücre lizatı büyük proteinleri uzaklaştırmak için süzülür ve AAV virüsü, Polietilen glikol (PEG) 8000 kullanılarak çökeltilir. 6. günde (D6), iyodiksanol saflaştırması ve konsantrasyonu gerçekleştirilir. Önceki günkü PEG konsantresi DNaz ile muamele edilir ve daha sonra bir iyodiksanol gradyanı ile yerleştirilir. Saflaştırılmış vektörler daha sonra tuzdan arındırılır ve bir santrifüj filtre kullanılarak konsantre edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İnkübatör kurulumu ve AAV verimleri. (A) Viral üretim hücreleri, 50 cm çalkalama çapına sahip bir çalkalama inkübatöründe kültürlenir. Bu inkübatör, mekatronik departmanı tarafından üretilen 600 mL'lik tüpler için bir adaptör plakası ve 50 mL'lik tüpler için özel ekler ile donatılmıştır. (B) İlk kurulumun ardından, raportör, transfeksiyon yöntemi olarak polietilenimin (PEI; 7.7 x 1012 GC toplamı, n=5) veya TransIt (2.4 x 1013 GC toplamı, n=5) kullanarak ve Verhaagen ve ark.12'de açıklandığı gibi klasik aderasyon yöntemiyle (2.6 x 1012 GC toplam, n=5) elde edilen verimlerle karşılaştırılarak oluşturur. Veriler ortalama ± Standart sapma olarak sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İn vivo değerlendirmeden sonra GFP ekspresyon modeli. (A) Her yerde bulunan promotör CMV hemen-erken arttırıcı, tavuk β-aktin promotörü ve tavşan β-Globin ek alıcı bölgesini (CAG) içeren tipik bir AAV vektör yapısının şematik tasviri, ardından Yeşil floresan proteini (GFP), Woodchuck Hepatit Virüsü (WHV) Posttranskripsiyonel Düzenleyici Eleman (WPRE) ve bir poliadenilasyon kuyruğu (pA)13. Burada, 6 haftalık dişi farelere (n = 3) 5 x 1011 toplam genomik kopya (gc) / fare içeren bir kuyruk damarı enjeksiyonu yapıldı. Enjeksiyondan 4 hafta sonra fareler sakrifiye edildi ve beyinler histoloji ile analiz edildi. (B) Polietilenimin (PEI) veya TransIt transfeksiyon reaktifi ile yapışık HEK293T hücreleri ve süspansiyon hücreleri kullanılarak sagital kesitlerde transdüksiyon paterninin temsili tasviri, kullanılan üretim yönteminden bağımsız olarak benzer bir transdüksiyon paterni gözlenir. Ölçek çubuğu = 1000 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Transfeksiyon yönteminden bağımsız olarak benzer lusiferaz aktivitesi. (A) Her yerde bulunan promotör CMV hemen-erken arttırıcı, tavuk β-aktin promotörü ve tavşan β-Globin ekleme alıcı bölgesi (CAG) lusiferaz (LUC) içeren yapının şematik tasviri, bir V5 etiketi ve bir sığır büyüme hormonu poliadenilasyon kuyruğu (BGHpA), 5 x 1011 GC toplamı / fare (n = 3) kuyruk damarı yoluyla enjekte edildi, kraniyal bölgedeki lusiferaz aktivitesi (kırmızı daire içine alınmış, örnek resimde) biyolüminesans görüntü olarak haftalık olarak ölçülmüştür. (B) Biyolüminesan aktivite, PEI üretimi için mavi bir çubuk ve TransIt için kahverengi bir çubuk olarak gösterilen bağıl lüminesans birimleri (RLU) olarak ölçülmüştür. Gruplar arasında seçilen beyin bölgesindeki lusiferaz aktivitesinde anlamlı bir fark gözlenmedi. Veriler ortalama ± Standart sapma olarak sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Transfeksiyon parametreleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: Uygulanan protokolün verimleri. AAV üretmek için diğer araştırmacılar tarafından kullanılan süspansiyon protokolü. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AAV'nin sistemik uygulaması, CNS'ye gen transferi için güçlü bir araçtır; ancak AAV üretimi pahalı ve zahmetli bir süreçtir. Süspansiyon hücreleri kullanılarak, 15cm2'lik plakalar üzerindeki HEK293T yapışan kültüre kıyasla işçilik ve plastikler azaltılır. Ayrıca, burada uygulanan konik boruların kullanımı kolaydır ve laboratuvar alanı kullanımını en üst düzeye çıkarır. Protokol iki araştırmacı tarafından oluşturuldu ve daha sonra laboratuvardaki diğer kişiler tarafından uygulandı. Üç bağımsız araştırmacı tarafından yapılan bir dizi üretim, ortalama olarak, 6-7 fareyi enjekte etmek için parti başına yeterli vektör verdi.
HEK293 süspansiyon hücrelerinin kullanımı daha önceaçıklanmıştır 13,14. Bununla birlikte, tarif edilen süspansiyon hücre hattı, araştırma amaçları için serbestçe mevcut değildir. Bu, açıklanan yöntemleri uygularken akademik araştırmacılar için bir darboğazdır. Bu protokolde açıklanan süspansiyon hücre hattı, araştırma amacıyla ücretsiz olarak kullanılabilir. Süspansiyon hücrelerinin kültürü, yerden ve zamandan tasarruf etmek için Erlenmeyer'inki yerine konik tüplerde yapıldı. Erlenmeyer's ile, konik borular kullanan 12 üretime karşılık aynı anda 4 adede kadar üretim kültürlenebilir. Konik tüpler hasat için doğrudan santrifüje aktarılabilir.
Bir süspansiyon hücre kültürü sistemi için alternatif bir olasılık, bakuloviral sistemdir. Baculo sisteminin bir avantajı, bu hücrelerin ve ortamın halka açık olması ve kolayca uygulanabilmesidir. Akademisyenler için, kullanıma hazır AAV transfer plazmitlerinden oluşan geniş bir kitaplık içeren Addgene gibi depolarmevcuttur 12. Bunlar, hatalı ITR'ler gibi uyarılara da sahip olsa da, tak ve çalıştır deneyleri için iyi bir kaynak görevi görürler. HEK293 tabanlı bir üretim sisteminin korunması için seçim yapıldı, çünkü mevcut plazmitler, yapının bakulovirüse aktarılması olmadan doğrudan üretim için kullanılabilir.
Transfeksiyon için polietilenimin nispeten ucuzdur ve bu nedenle tercih edilen transfeksiyon reaktifidir. Alternatif olarak, vektörlerin verimini artırmak için yeni bir transfeksiyon yöntemi (TransIt) değerlendirildi. Plazmit miktarının yarısı kullanılarak üç kat iyileşme gözlendi. Bu, TransIt'i daha büyük stoklara ihtiyaç duyulduğunda ilginç bir alternatif transfeksiyon reaktifi haline getirir. Bunun bir sınırlaması, küçük partiler için daha az ilgi çekici hale getiren maliyettir.
Özet olarak, burada, akademik bir laboratuvar ortamında süspansiyon hücrelerinde yüksek verimli AAV üretmek için kullanılabilecek bir protokol sunulmaktadır. AAV'yi yüksek verimle üretmek için akademik bir laboratuvar ortamında kullanılabilecek araçlar açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
İlk test için Mirus tarafından ücretsiz bir TransIT numunesi sağlandı ve ardından reaktif daha sonra kullanılmak üzere satın alındı. Yazarların rapor edecek başka bir rakip mali çıkarı yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Hollanda Kraliyet Sanat ve Bilim Akademisi (KNAW) araştırma fonundan bir hibe ve Start2Cure'dan (0-TI-01) bir hibe ile desteklenmiştir. Protokolün kurulumundaki katkıları ve tavsiyeleri için Leisha Kopp'a teşekkür ederiz. Figürler Biorender kullanılarak oluşturuldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep - Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
References
- Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).
- Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).
- Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
- Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960 (2019).
- Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
- Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
- Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
- Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
- Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).
