Summary
在这里，我们提供了一个完整的协议，用于标准化和实施通过逆转录环介导的等温扩增 （RT-LAMP） 检测人类样本中 SARS-CoV-2 病毒的方法。这种方法在 60 分钟内完成，可以以低成本和廉价的设备适用于任何实验室或护理点。
Abstract
严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） 病毒对人类健康产生了巨大影响。它仍然是对现代社会的威胁，因为许多人因感染而死亡。该疾病通过血清学和分子检测进行诊断，例如金标准实时聚合酶链反应 （RT-PCR）。后者有几个缺点，因为它需要专门的基础设施、昂贵的设备和训练有素的人员。在这里，我们提出了一种协议，概述了在人类样本中使用逆转录环介导的等温扩增 （RT-LAMP） 检测 SARS-CoV-2 病毒所需的步骤。该方案包括 计算机模拟设计引物、制备试剂、扩增和可视化的说明。一旦标准化，这种方法可以在 60 分钟内以低成本和廉价的设备轻松实施并适应任何实验室或护理点。它适用于检测不同的病原体。因此，它有可能在现场和卫生中心使用，以开展及时的流行病学监测。
Introduction
严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） 导致 2019 冠状病毒病 （COVID-19）。世界卫生组织于 2020 年 1 月 30 日宣布为国际关注的突发公共卫生事件，并于 2020 年 3 月 11 日宣布为大流行。截至本文撰写之日，大流行已导致超过 7.6 亿例病例和 687 万人死亡1.
这种病毒的影响凸显了需要更好、更准确、更快和更广泛可用的监测工具，以改善传染病的检测和控制2,3。在大流行期间，SARS-CoV-2 诊断测试基于检测核酸、抗体和蛋白质，但核酸的 RT-PCR 检测是金标准4。然而，RT-PCR有一些局限性;它需要专门的设备、基础设施和接受过分子生物学培训的人员，将其应用限制在专业实验室。此外，它很耗时（4-6 小时），不包括将标本运送到实验室的时间，这可能需要第5 天。这些制约因素妨碍了有效的样本处理和获取应急计划和流行病学管理所需的信息。
与RT-PCR相比，逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）具有多项优势，使其成为设计未来即时诊断检测（POCT）的有吸引力的策略，特别是在资源有限的环境中6。首先，它具有极强的特异性，因为它使用四到六个引物来识别靶序列中的六到八个区域，无论是 DNA 还是 RNA 7,8。其次，由于它在恒定温度下运行，因此不需要复杂的设备（如实时热循环仪）来产生扩增，也不需要训练有素的人员来操作。第三，反应时间很短（~60 min），并且采用了不是很专业的试剂，这使其成为一种具有成本效益的工具6.鉴于上述情况以及 COVID-19 大流行造成的突发卫生事件，该技术可以被视为一种替代诊断方法，该方法快速、廉价且易于在任何研究实验室中实施9.
本文描述了标准化和实施RT-LAMP以使用热循环仪和水浴通过比色法检测SARS-CoV-2的协议（图1）。讨论了关键点、它们的局限性以及推进这些临界点的替代方案。
图 1：使用 RT-LAMP 技术扩增 SARS-CoV-2 的方案。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Protocol
使用的样本由 Fundación Valle del Lili 大学医院的临床实验室提供，对应于 使用 RT-qPCR 技术检测出 COVID-19 阳性的患者的纯化 RNA。所有患者都为研究提供了知情同意书，该研究得到了 Fundación Valle del Lili 大学医院的人类研究生物伦理委员会的批准。
1. RT-LAMP底漆设计与制备
注：LAMP 引物可用于多种平台，包括 New England BioLabs （NEB） LAMP、Primer Explorer 和 LAMP assay versatile analysis （LAVA）。但是，对于此协议，使用了NEB LAMP工具。可以使用从 NextStrain 数据库10 获得的 SARS-CoV-2 基因组进行引物设计。 表1 显示了该协议中使用的引物组。
- LAMP的底漆设计
- 获取病毒基因组序列。
- 执行序列比对以获得共识序列。
- 导航到 NEB LAMP 引物设计工具平台11，并按照快速指南中的说明进行操作。该工具产生与引物探索器 V5 相同的结果，但它的输出更加人性化。使用引物浏览器用户手册作为引物设计的指南。
- 引物组的热力学评价
- 使用Primer-Dimer12 工具对获得的引物进行热力学分析。
- 将引物序列放入工具中。然后，选择选项 多路复用分析和二聚体结构报告。
- 选择ΔG不小于-5的引物组。
- 设计引物的特异性评价
- 使用 BLAST13 中的核苷酸收集 （nt/nt） 数据库分析每种引物。
- 要执行第一次 BLAST 分析，请选择 Refseq_rna 数据库，并使用属于 Orthocoronavirinae 亚科的属组过滤搜索。它们是阿尔法冠状病毒（taxid：693996）、γcoronavirus（taxid：694013）和Deltacoronavirus（taxid：1159901）。此外，评估针对作为 H1N1 亚型 （taxid：114727）、甲型流感病毒 （taxid：11320） 和乙型流感病毒 （taxid：11520） 共同传播的其他病毒的序列。
- 要执行第二次BLAST分析，请选择Betacoronavirus GenBank，并使用Coronaviridae（taxid：11118）和SARS（taxid：694009）过滤搜索。这些组包含所有已确定的SARS冠状病毒基因组的序列，包括在蝙蝠中发现的基因组，Betacoronavirus（taxid：694002）。
- 对于该协议，请确保引物与目标基因组 SARS-CoV-2 以外的基因组不一致。
- 引物制备
- 用微量离心机（10,000× g，室温[RT]下1分钟）旋转含有Iyophilized引物的小瓶，以避免在管打开期间损失。
- 将Iyophilized粉末在0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水或无核酸酶水中再水化至终浓度为100μM（表2），并通过上下移液彻底溶解。然后，在微量离心机中以最大速度（10,000× g，室温下1分钟）旋转，以收集管底部的所有引物溶液。
- 如 表2所示，在生物安全柜下使用前向内引物（FIP）、后向内引物（BIP）、前向外引物（F3）、后向引物（B3）、环向后（LB）和环前向（LF）引物制备10x引物混合物。为防止损失，在用微量离心机进行快速旋转（10,000× g，室温下1分钟）之前，移液管或轻轻涡旋引物溶液。
- 将10x引物混合物储存在−20°C下以进行长期储存;但是，无论使用多个样品，都应为最多五次实验做好准备，以避免过多的冻融循环。
注意：如果需要较小体积的引物混合物，则通过计算新体积来调整值（表2）。此外，RdRp 和 RdRp/Hel 组不包括 LF 引物，因为 RT-LAMP 反应不需要环引物。因此，用无核酸酶水或0.1%DEPC水替换LF引物的体积。
2. RT-LAMP反应
- 根据制造商的说明打开层流柜，并等待至少 3 分钟，让气流稳定下来。
- 一旦气流稳定，使用无菌技术清洁和消毒机柜的内表面。为此，请按以下顺序使用以下消毒剂：1000 ppm 季铵（苯扎氯铵）、2% 次氯酸盐、3% 过氧化氢和 70% 乙醇。
注意：在这种情况下，无菌技术需要涂抹消毒剂并用餐巾纸从机舱内部到外部将其清除，而无需经过先前清洁过的表面。 - 使用步骤 2.2 中的消毒剂，以相同的顺序清洁将进入机舱的材料。
注意：必须将微量移液器、过滤吸头盒、带有 1.5 mL 和 0.6 mL 试管的烧瓶、0.2 mL PCR 管、支架和 400 mL 烧杯带入机柜。 - 将一些餐巾纸和丁腈手套带入机舱。之后，关闭机柜并将其暴露在紫外线 （UV） 下 15 分钟。
注意：为避免长时间暴露于辐射造成的组织和 DNA 损伤，请在步骤 2.4 中设定的时间到期之前避免使用紫外线。
注意：在开始协议之前执行 图 2 中所示的组装，并在完成步骤 2.4 后开始水浴。至关重要的是，将金属容器装满饮用水，并将铁实验室加热板的温度设置为 90 °C，因为这将导致系统中的温度为 ~66.3 °C，使用水银温度计进行监测。 - 辐照期结束后，重新启动机柜并按照步骤 1.1 中的建议进行操作。
- 将试剂（表3、表4和 表5）置于充满冰的冷却器或小型聚苯乙烯冰箱中。用 70% 乙醇清洁后将容器放入柜内。
- 在 0.6 mL 微量离心管中，制备待扩增基因的 LAMP 混合物（RdRp、N-A 和 RdRp/Hel），仅加入以下组分：10x 缓冲液、MgSO4、dNTP、1x 引物混合物和无核酸酶水或 0.1% DEPC 水;通过移液使均匀混合。
注意：由于机柜内的处理和行为不当，试剂污染的风险很高。为了缓解这个问题，必须遵循以下规则：（i） 使用无菌和过滤吸头;（ii） 每种试剂使用一个吸头;（iii） 缓慢而小心地移动，以避免破坏层流;（iv） 维持秩序并使用最少的材料;（v）使用不同的手套制备混合物并添加遗传物质。
注意：将所有试剂（尤其是酶）放在冰上，因为温度变化会使它们变性并改变聚合酶活性。 - 将 0.6 mL 管（s）盖子关闭放入加热块中，并在 95 °C 下孵育 5 分钟。
注意： 在开始 LAMP 混合物制备之前，打开位于机柜外的 1.5-2.0 mL 管的加热块至少 30 分钟，并使用水银或酒精温度计监测温度 （95 °C）。 - 孵育完成后，将试管放入充满冰的聚苯乙烯冷却器中5分钟。
- 将试管返回到层流柜中，并通过添加酶DNA聚合酶（Bst 3.0），逆转录酶和高保真DNA聚合酶完成LAMP混合物制备（表3，表4和 表5）。在使用比色检测的情况下，加入染料羟氧西酚蓝（HNB）。
- 加入这些试剂后，通过移液将 LAMP 试剂充分混合，以溶解酶和染料。
- 用 22.0 μL 混合物填充每个 PCR 管，注意不要产生气泡。然后，将 3.0 μL 0.1% DEPC 水或无核酸酶水加入阴性对照或管无模板对照 （NTC） 中，并留出剩余的管用于添加（遗传物质）。
注意：将PCR管保持在充满冰的冷却器中，直到添加样品，以避免激活 Bst 3.0酶并过早开始反应。 - 从机柜中取出所有材料，并使用 70% 乙醇清洁表面。然后按照制造商的说明将其关闭。
- 在单独的区域中，将 3 μL 样品添加到每个 PCR 管中并彻底均一化。使用 20 μL 微量移液器和过滤器吸头来实现此目的。
注意：用于添加遗传物质的微量移液器必须专门用于此目的，不能用于制备混合物。通过这种方式，可以避免试剂的污染。此外，始终将 RNA 样品放在冰上，以减少 RNA 降解的可能性。使用以下个人防护设备 （PPE） 添加样品：一次性防护服、帽子、N95 口罩、紧身裤、实验室护目镜和丁腈手套。 - 在进行比色反应之前，用高质量相机拍摄PCR管的照片。HNB 的起始颜色是紫罗兰色。
- 在以下系统或设备中进行反应：（i） 热循环仪和 （ii） 水浴。
- 热循环仪：将试管放入反应块中，并在设备上设置热分布仪（见 表6）。
- 水浴：将管子放入圆形容器中，并很好地调整它们以防止它们流出。之后，将容器置于水浴中（图2A，B），温度为表6中列出的温度。
- 在水浴的情况下，一旦管子进入系统内部，启动计时器 60 分钟（表 6）。
- 反应时间后，从热循环仪或水浴中取出试管，并将它们储存在4°C进行电泳运行，或储存在-20°C直至使用。
- 如果进行了比色反应，则使用高质量相机拍摄PCR管的照片。HNB的最终颜色是天蓝色。
3. 琼脂糖凝胶中扩增产物的分析
注：建议将这些步骤作为在标准化步骤中对比色反应或性能控制的附加检查。这是因为该技术可能会给进行这些测试的实验室带来巨大的污染风险。
- 将床放在电泳室内，使边缘橡胶接触壁，从而为添加琼脂糖（内室）形成一个密封空间（图3A，B）。
- 完成步骤 3.1 后，在 500 mL 烧杯中称量所需量的琼脂糖以获得 2% 凝胶。之后，加入所需体积的0.5x Tris-乙酸EDTA（TAE）缓冲液和微波炉1-2分钟。
注意：琼脂糖在从烤箱中取出时是半透明且无结块时会完全熔化。如果这一点没有得到证实，可能会留下凝胶不良的区域，导致电泳运行和扩增产物的可视化发生变化。 - 将烧杯从烤箱中取出，将琼脂糖倒入步骤3.1中创建的内腔中（图3C）。随后，检查是否没有气泡，如果有，请使用微量移液器吸头将其去除。
- 布置梳子形成孔，并将琼脂糖在室温（RT）下凝胶约30分钟。
- 在此时间之后，加入 5 mL 的 0.5x TAE 缓冲液以利于去除梳子和含有凝胶的床。然后以使孔位于阳极中的方式放置凝胶（图3D）。
- 用0.5x TAE缓冲液填充电泳室至制造商指定的容量，确保电极与缓冲液接触。
- 向凝胶的第一个孔中加入 3 μL 分子量标记物，并将 9 μL NTC 和每个样品加入到下一个孔中。通过将 7 μL 扩增产物与 3 μL 上样缓冲液混合来制备这些样品;然后将 9 μL 该混合物加载到凝胶的孔中。
- 用盖子盖住电泳室，并以颜色图案将电缆连接到电源端口。将电源设置为以下参数：100 V 和恒定 amp120 分钟。
- 电泳运行完成后，将凝胶放入装有染色溶液（溴化乙锭）的容器中，孵育30分钟。
- 孵育后，从染色溶液中取出凝胶，并将其放入拉链袋中。这样可以防止用于可视化扩增子的设备受到污染。
- 在透射仪或成像仪（如 Amersham Imager 600）上观察凝胶。
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Representative Results
该协议的实施首先要按照上述协议为每个靶基因设计一组引物。2020 年 6 月，从 NextStrain 数据库获得了 5,000 个 SARS-CoV-2 基因组，哥伦比亚基因组的代表性为 10%。对这些序列进行比对，以获得引物设计过程中使用的共识序列。 表 1 显示了为引物 RdRp/Hel 和 RdRp 选择的引物组。基因 N 扩增的引物组来自先前发表的报告14。
协议标准化的第一步是避免NTC放大。在这方面，必须验证的最重要参数之一是确定引物组的最佳熔解温度 （Tm） 和 Bst 3.0 浓度。温度梯度用于确定扩增的最佳Tm （图4A）。对于该协议中使用的一组引物，最佳Tm 为66.3°C（图4A）。此外，还评估了不同浓度的 Bst 3.0酶，其中3.2 lU/μL是该反应的最佳浓度（图4B）。Lu等人15 提供的浓度用于剩余的试剂（表3、 表4和 表5）。
一旦确定了 Tm 和 Bst 3.0 的最佳浓度，就进行扩增过程。患者样本由大学医院Fundación Valle del Lili提供。阳性和阴性样品先前使用常规 RT-PCR 方案扩增，然后使用此处描述的方案和列出的条件将病毒 RNA 用于 RT-LAMP 扩增。N、RdRp/Hel 和 RdRp 基因在患者样本中的扩增，但在 NTC 中未扩增， 如图 5A、B 所示。鉴于RT-LAMP是未来设计POCT的一种吸引人的策略，该协议中的扩增是在传统的热循环仪和水浴中实现的（图6）。
标准化方案的第二步是定义比色策略，因此酚红和中性红是首先评估的染料;为了进行评估，探测了不同的染料浓度（图7），但在使用任何测试浓度进行扩增后均未观察到颜色变化。这一结果可以通过以下事实来解释：两种染料都是pH指示剂，这意味着它们对样品的pH值敏感，特别是如果病毒RNA在缓冲液TE中洗脱，则使用该协议评估的患者样品就是这种情况。研究了羟基萘酚蓝（HNB），因为它的颜色随着Mg 2+浓度的变化而变化，在扩增反应过程中，Mg2+浓度会作为聚合酶的辅助因子而减少。在这种情况下，测试了不同浓度的HNB，以确定哪种浓度的HNB在扩增后允许最佳的颜色变化，这在与125μM HNB的反应中发生（图8）。 表5包括通过比色LAMP制备N和RdRp/Hel基因扩增混合物所用试剂的完整描述。
在确定比色检测的最佳条件后，对具有不同数量病毒基因组的患者样本进行扩增。 图9 显示了样品的扩增，其中根据病毒基因组的浓度，样品中的颜色会发生变化。还使用琼脂糖电泳观察了扩增结果，确认了患者样本的扩增，但未确认 NTC。
图 2：使用 LAMP 技术扩增 SARS-CoV-2 基因的水浴图。 （A） 前视图和 （B） 顶视图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：电泳室组件。 （A） 用于分离PCR产物的电泳室示意图。（B）形成用于制备琼脂糖凝胶的内室。（C） 在内室中加入熔融琼脂糖。（D） 拆卸内腔以将凝胶置于运行位置。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：引物和酶 Bst 3.0 扩增条件的标准化。 （A） 每个泳道显示不同的梯度温度，范围从 63 °C 到 67 °C。 从左到右，分子量标记物 （MWM），无模板对照 （-），泳道 1：67 °C;泳道 2： 66.8 °C;泳道 3：66.3 °C;泳道 4：65.5 °C;泳道 5： 64.6 °C;泳道 6：63.9 °C;泳道 7： 63.4 °C;泳道 8：63 °C。 （B） B1：8.0 U/μL Bst 3.0;B2：6.4 U/μL Bst 3.0;B3：4.8 U/μL Bst 3.0;B4：3.2 U/μL Bst 3.0;1：无模板控制;和 2：患者样本 EEDD8 （Ct = 23.39）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：使用 LAMP 技术对 SARS-CoV-2 病毒中存在的 N 和 RdRp/Hel 基因的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。 （A） 重复 1 和 （B） 重复 2，其中 MWM：分子量标记;1：无模板控制;2：患者样本E1123（Ct=19.95）;3：患者样本E1324（Ct=26.01）;4：患者样本EEDD10（Ct=30.09）;RH：RdRp/Hel基因和N：N基因。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：使用 LAMP 技术对 SARS-CoV-2 病毒中存在的 RdRp 基因的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。 反应在（A）热循环仪和（B）水浴系统中进行。MPM： 分子量标记物;1：无模板控制;2：患者样本E1123（Ct=19.95）;3：患者样本E1757（Ct=23.67）;4：患者样本E1604（Ct=23.98）;5：患者样本E1245（Ct=25.99）;6：患者样本E1324（Ct=26.01）;7：患者样本EEDD7（Ct=26.56）;8：患者样本24（Ct=37.99）和R：RdRp基因。*指经过 60 分钟反应的扩增。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：使用 LAMP 技术与比色检测对 SARS-CoV-2 病毒中存在的 RdRp 基因进行扩增。 反应前（A）管和反应后（B）管，其中1：无模板对照;2：患者样本E1123（Ct=19.95）;3：患者样本E1757（Ct=23.67）;4：患者样本E1324（Ct=26.01）;PR：酚红;NR：中性红。对于每种染料，在最终反应中评估四种浓度（50 μM、75 μM、100 μM 和 120 μM）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：使用蓝色羟基萘酚指示剂，通过比色 LAMP 技术扩增 SARS-CoV-2 病毒中存在的 RdRp 基因。 反应前（A）管和反应后（B）管，其中1：无模板对照;2：患者样本E1594（Ct=20.75）;3：患者样本E990（Ct=22.67）;4：患者样本E1245（Ct=25.99）。对于该染料，在最终反应中评估四种浓度（50 μM、75 μM、100 μM 和 125 μM）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 9：样品的扩增。 管（A）反应前和反应后（B）使用蓝色羟基萘酚指示剂。（C） 使用比色 LAMP 技术对 SARS-CoV-2 病毒中存在的 N 基因扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。MPM： 分子量标记物;NTC：无模板控制;S1：患者样本E1594（Ct=20.75）;S2：患者样本E990（Ct=22.67）;S3：患者样本 E1245 （Ct = 25.99）。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 目标基因 | 底漆 | 引物序列 （5' → 3'） | |||
| N （Zhang et al.， 2020） |
N-F3型 | TGGCTACTACCGAAGAGCT | |||
| N-B3型 | TGCAGCATTGTTAGCAGGAT | ||||
| N-FIP（N-FIP） | TCTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTCCAGACGAATTCGTGGTGGGG | ||||
| N-BIP | AGACGGCATCATATGGGTTGCACGGGTGCCAATGTGATCT | ||||
| N-LF系列 | GGACTGAGATCTTTCATTTTACCGT | ||||
| N-磅 | ACTGAGGGAGCCTTGAATACA | ||||
| RdRp | R-F3型 | CTATGGTGGTTGGCACAA | |||
| R-B3型 | TTGAGCACACTCATTAGCT | ||||
| R-FIP（R-FIP） | GCATGGCTCTATCACATTTAGGATA-GTTTATAGTGATGTAGAAAACCCTC | ||||
| R-BIP型 | ACATGCTTAGAATTATGGCCTCAC-TCTATAGAAACGGTGTGACAAG | ||||
| R-LB型 | TGTTCTTGCTCGCAAACATACAACG | ||||
| RdRp/Hel | RH-F3型 | GGTATTGGGAACCTGAGTT | |||
| RH-B3型 | GACAAGACTAATTTATGTGATGTTG | ||||
| RH-FIP型 | GCAAAGAACACAAGCCCCAACTTATGAGGCTATGTACACACC | ||||
| RH-BIP型 | TTCACAGACTTCATTAAGATGTGGTACATGGTCGTAACAGCAT | ||||
| RH-LB型 | GCTTGCATACGTAGACCATTCTT | ||||
表 1：通过 RT-LAMP 检测 SARS-CoV-2 的引物序列。
| 元件 | 原液 （μM） | 引物混合物 10x （μM） | 体积 （μL） |
| 正向外底漆 （F3） | 100 | 2 | 12.5 |
| 后外底漆 （B3） | 100 | 2 | 12.5 |
| 正向内引物 （FIP） | 100 | 8 | 50 |
| 后向内底漆 （BIP） | 100 | 8 | 50 |
| 环向前向 （LF） | 100 | 4 | 25 |
| 循环回溯 （LB） | 100 | 4 | 25 |
| 无核酸酶水* | --- | --- | 450 |
| 总体积 | 625 | ||
表2：10x RT-LAMP引物混合物的制备。 RdRp基因引物混合物不含LF引物;因此，用无核酸酶的水代替该体积。*可以使用在DEPC 0.1%水中制备的10 mM Tris pH 8.0代替无核酸酶的水。
| 项目 | 试剂 | 25 μL 的终浓度 | 1 个样品 （μL） |
| 1 | 10x 缓冲液 | 1 倍 | 2.5 |
| 2 | 100毫米MgSO 4 | 缓冲液中 4 mM + 2 mM = 6 mM | 1.0 |
| 3 | 10 毫米 dNTP | 1.4毫米 | 3.5 |
| 4 | 10x 混合底漆 | 1x [ 0.2 μM F3 / B3; 0.8 μM FIP / BIP; 0.4 μM LB] | 2.5 |
| 5 | Bst 3.0 DNA pol （8000 IU/mL） | 3.2 国际单位 | 0.4 |
| 6 | RTx（15000 IU/毫升） | 1.5 国际单位 | 0.1 |
| 7 | Q5 DNA pol （2000 IU/mL） | 0.15 国际单位 | 0.1 |
| 8 | 无核酸酶水 | N/A | 11.9 |
| 9 | RNA样品 | N/A | 3.0 |
| 10 | 总反应体积 | 25 | |
表3：通过LAMP制备RdRp基因扩增混合物。
| 项目 | 试剂 | 25 μL 的终浓度 | 1 个样品 （μL） |
| 1 | 10x 缓冲液 | 1 倍 | 2.5 |
| 2 | 100毫米MgSO 4 | 缓冲液中 6 mM + 2 mM = 8 mM | 1.5 |
| 3 | 10 毫米 dNTP | 1.4毫米 | 3.5 |
| 4 | 10x 混合底漆 | 1x [ 0.2 μM F3 / B3; 0.8 μM FIP/BIP; 0.4 μM LF / LB] | 2.5 |
| 5 | Bst 3.0 DNA pol （8000 IU/mL） | 3.2 国际单位 | 0.4 |
| 6 | RTx（15000 IU/毫升） | 1.5 国际单位 | 0.1 |
| 7 | Q5 DNA pol （2000 IU/mL） | 0.15 国际单位 | 0.1 |
| 8 | 无核酸酶水 | N/A | 11.4 |
| 9 | RNA样品 | N/A | 3.0 |
| 10 | 总反应体积 | 25 | |
表4：LAMP制备N-A和RdRp/Hel基因的扩增混合物。
| 项目 | 试剂 | 25 μL 的终浓度 | 1 个样品 （μL） |
| 1 | 10x 缓冲液 | 1 倍 | 2.5 |
| 2 | 100毫米MgSO 4 | 缓冲液中 6.5 mM + 2 mM = 8.5 mM | 1.6 |
| 3 | 10 毫米 dNTP | 1.4毫米 | 3.5 |
| 4 | 10x 混合底漆 | 1x [ 0.2 μM F3 / B3; 0.8 μM FIP/BIP; 0.4 μM LF / LB] | 2.5 |
| 5 | 1 mM羟基萘酚蓝 | 125微米 | 3.1 |
| 6 | Bst 3.0 DNA pol （8000 IU/mL） | 3.2 国际单位 | 0.4 |
| 7 | RTx（15000 IU/毫升） | 1.5 国际单位 | 0.1 |
| 8 | Q5 DNA pol （2000 IU/mL） | 0.15 国际单位 | 0.1 |
| 9 | 无核酸酶水 | N/A | 8.2 |
| 10 | RNA样品 | N/A | 3.0 |
| 11 | 总反应体积 | 25 | |
表5：通过比色LAMP制备N-A和RdRp/Hel基因的扩增混合物。
| 温度 | 时间 |
| 66.3°摄氏度 | 60 分钟 |
| 80 摄氏度 | 5 分钟 |
| 4 摄氏度 | ∞ |
表 6：LAMP 扩增 RdRp、N-A 和 RdRp/Hel 基因的热条件。
| 染 | pH 值依赖性 | 反应前的颜色 | 反应后颜色 | 评论 | ||
| 羟基萘酚蓝 | 不 | 紫 | 天蓝色 | 使用这种染料时，镁浓度至关重要，在最终反应中必须在 8 mM 和 8.5 mM 之间。通过这种方式，保证了从紫罗兰色到天蓝色的颜色过渡。 | ||
| 甲酚红 | 是的 | 福西亚 | 黄色 | RNA洗脱液或试剂中存在缓冲液会阻止pH值降低，并影响反应结束时的颜色变化。因此，在 RNA 和引物的情况下，建议不要分别使用 TE 缓冲液进行洗脱和重悬/稀释。 | ||
| 中性红 | 是的 | 淡黄色或淡橙色 | 福西亚 | |||
| 酚红 | 是的 | 福西亚 | 黄色 | |||
表7：比色LAMP视觉检测中使用的染料比较。
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Discussion
尽管RT-LAMP被认为是执行分子诊断的补充方法，但它也有一些局限性和关键步骤，在标准化和实施协议时必须考虑这些限制和关键步骤。
用于检测 SARS-CoV-2 的 LAMP 标准化评估了预混液中的以下参数和成分：（a） 引物的浓度和比对温度;（b） 酶的浓度;（c） 镁浓度;（d） 反应时间;（e） 含有BSA、DMSO、氯化胍等添加剂;（f） 引物的设计;（g） 添加着色剂;（h） 使用内部生产的反应缓冲液和重组酶。
该标准化过程始于六套引物，其中两套由Zhang等人报告14 ，四套由BioDx公司设计。后者是使用可用的在线工具从头开始设计的，并因其对 SARS-CoV-2 的高特异性而被选中，由 BLAST 确定。此外，他们的热力学评估显示，形成引物二聚体或发夹结构的倾向较低，有利于自扩增。
由于引物对技术标准化的影响以及先前在NTC中发现扩增的实验结果，因此针对N、S、RdRp和RdRp/Hel基因进行了新的引物设计。这些进行了几次生物信息学分析，以保证它们的特异性并减少形成自扩增结构的趋势。所选引物符合既定的生物信息学参数（ΔG > -5.0，BLAST证明的特异性）。
计算机模拟测定在预测体外反应中可以观察到的行为方面具有非常重要的作用，因为它们可以用作选择引物的初始过滤器。然而，这些预测并非在所有情况下都相同;因此，它们不能用作确定的选择参数，而是用作初始近似值。该技术中引物的实际行为是在反应过程中直接通过比色法或在琼脂糖凝胶上进行目视评估确定的。最后，可疑或不清楚的结果通常会被另一位分析师重复或丢弃;因为在诊断的背景下不能报告不确定的结果。
最重要的关键步骤之一是在制定协议时污染的可能性很高，这反映在NTC的放大上。这可以通过遵循良好的实验室规范来避免，例如在处理试剂和样品之前进行适当的消毒和清洁程序，始终佩戴所需的个人防护装备，在层流柜内小心处理工具，并在单独的空间中开发过程的每个步骤供专用，例如一个空间用于混合试剂，另一个空间用于添加要评估的样品，另一个空间用于执行扩增过程。
NTC放大可能是由污染引起的，也可能是由引物二聚化引起的。因此，另一个关键步骤是引物设计并确定防止引物二聚化的最佳条件。在引物设计过程中，找到具有热力学参数的引物组至关重要，该引物组的热力学参数可以降低二级结构形成的可能性，而二级结构形成是用自由能测量的，因此需要对所选的引物组进行热力学评估。在该协议中，采用PrimerDimer工具12 进行热力学评价;使用多重检测选项，将每个引物与池中的所有其他引物进行筛选，以寻找潜在的二聚体形成，而“二聚体框架报告”选项则报告每个引物对中最稳定的二聚体的框架。这些信息对于选择一套好的引物非常有帮助。
此外，确定适当的试剂浓度（如 MgSO4、dNTP、引物、 Bst 3.0 酶）和扩增参数（如 Tm 和孵育时间）对于防止扩增过程中引物二聚化至关重要。此外，还可以添加减少扩增过程中引物二聚体形成的化合物，例如牛血清白蛋白、二甲基亚砜 （DMSO）16 和氯化胍17。
引物设计过程的另一个关键环节是确定每种引物的特异性。对于该协议，此评估是使用 BLAST 进行的。然而，使用另一种在系统发育上相关但与 SARS-CoV-2 无关的病毒评估引物扩增过程的特异性也很重要。
另一方面，在技术标准化过程中，没有确定灵敏度和检测限（可检测基因组的最小数量）。首先，由于哥伦比亚当时（2020 年）实施的卫生应急措施造成的内部限制，没有对 Fundación Valle del Lili 大学医院提供的样本进行量化以确定病毒拷贝数。遗传物质浓度的估计值与RT-qPCR的Cq近似，因为Cq越低，病毒拷贝数越高，而Cq越高，病毒拷贝数越低。测试的最低Cq为14.81，最高为38.93，其中未出现扩增产物。 此外，在 2020 年，哥伦比亚批准使用的 RT-qPCR 测试是定性的而不是定量的，也就是说，仅根据 Cq 确定存在或不存在。Cq ≥ 40 的结果为阴性，但 Cq < 40 的结果为阳性。哥伦比亚用于检测 COVID-19 的方案是柏林协议 1、CDC 2019-新型冠状病毒 （2019-nCoV） 实时 RT-PCR 诊断面板2，特别是在 Fundación Valle del Lili 大学医院，使用了 Allplex 2019-nCoV Assay3。不幸的是，我们没有更多的样本得到伦理委员会的批准，这些样本是由Valle del Lili大学医院提供的，可以继续进行这些实验。
此外，在由SARS-CoV-2引起的全球突发公共卫生事件中，试剂的可用性是及时诊断新病例的重大障碍。因此，创建该协议是为了避免使用进口和昂贵的商业试剂盒和试剂，并且该协议中详细介绍了扩增缓冲液的制备。此外，还评估了一些可用于比色测定的染料，以及使用它们的一些注意事项（表7）。
这种诊断方法有一些局限性，因为它不允许对样本中的病毒基因组进行定量。此外，颜色检测是一种主观测量，因为它取决于执行协议的人员的视觉能力。然而，由于它不需要受过分子生物学培训的专门设备或人员，因此该协议适用于不同病原体的检测，并且一旦标准化，就可以很容易地实施。因此，其应用可以扩展到其他样本，如环境18、19、20 和卫生中心，以便及时开展流行病学监测。
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Disclosures
纳塔利娅·坎皮略-佩德罗萨（Natalia Campillo-Pedroza）是BioDx： Diagnóstico y Soluciones Biotecnológicas S.A.S.公司的首席执行官。其余作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作由哥伦比亚的Sistema General de Regalías资助，资助号为BPIN 2020000100092，Universidad Icesi - Convocatoria Interna，资助号为CA0413119。MFVT还得到了安第斯大学的助理教授基金的资助。资助实体没有参与手稿的设计、活动执行、数据收集、数据分析和准备。我们感谢 Valle del Lili 大学医院提供来自 SARS -CoV-2 样本的病毒 RNA，并感谢 Alvaro Barrera-Ocampo 博士对手稿的评论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb DNA Ladder | SOLIS BIODYNE | 07-12-00050 | Store at -20 °C |
| 50x TAE Electrophoresis Buffer | ThermoScientific | B49 | Store at roome temperature |
| Accuris High Fidelity Polymerase | ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS | PR1000-HF-200 | It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
| Agarose | PanReacAppliChem | A8963,0100 | N/A |
| Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL | New England BioLabs | M0374S/M0374L | For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England BioLabs | N0446S | Store at -20 °C |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220-25G | Handle it with caution under an extraction cabinet |
| GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use | ThermoScientific | SM0322 | Store at -20 °C |
| Hydroxy naphthol blue disodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-215156B | N/A |
| Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL | New England BioLabs | M0491S/M0491L | For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL | New England BioLabs | M0380S/M0380L | For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
References
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