עיכול אנזימטי ודיסוציאציה ידנית: שיטה להכנת עוברים מסוג C. elegans לתרבית תאים

Abstract

מקור: Sangaletti, R. and Bianchi, L. שיטה לגידול תאי C. elegans עובריים.J. Vis. Exp.(2013).

סרטון זה מציג שיטה לבידוד ותרבית סטרילית של תאי C. elegans עובריים במבחנה.

Protocol

1. דיסוציאציה של תאים עובריים

1. בצע את השלבים הבאים של ההליך בתנאים סטריליים באמצעות מכסה מנוע זרימה למינרית. בעוד בעלי חיים לבושים על צלחות חיידקים, השטיפות והטיפול בתמיסת הליזיס המכילה אקונומיקה אמורים לחסל את רוב אם לא את כל החיידקים. לפיכך, שימוש במכסה מנוע למינרי בשלב זה של ההליך מונע זיהום חדש של תרחיף הביצה.
2. מרחפים ביצים בכדוריות ב-1 מ"ל של כיטינאז במינון 2 מ"ג/מ"ל (מלאי ב-pH 6.5) ומעבירים אותן לצינור חרוטי סטרילי חדש בנפח 15 מ"ל. רוק את הצינור במשך 10-30 דקות בטמפרטורת החדר. זמן הדגירה המדויק משתנה בהתאם לרעננות האנזים ולטמפרטורת החדר ולכן יש לקבוע אותו לכל תכשיר. מומלץ להתחיל לעקוב אחר הביציות תחת מיקרוסקופ תרבית תאים הפוכ....

Results

איור 1. C. elegans עוברים לפני ואחרי טיפול בכיטינאז. (A) צילום ביצים לפני חשיפה לכיטינאז. החץ מצביע על קליפת הביצה השקופה והשלמה המקיפה עובר. (B) ביצים שטופלו בכיטינאז במשך 10 דקות. קליפות הביצים התעכלו ואינן נראות עוד סביב העוברים. החיצים מצביעים על עוברים משולשים ששוחררו מקליפת הביצה. התיבה הכחולה מקיפה קבוצת תאים שעדיין מחוברים זה לזה.

....

Materials

<גבול טבלה="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="738"> List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments REAGENTS Leibovitz's L-15 Medium (1x) נוזל Invitrogen 11415-064 סרום בקר עוברי Invitrogen 16140-063 פניצילין-סטרפטומיצין סיגמא P4333-100ML Chitinase from Streptomyces Griseus סיגמא C6137-25UN Peanut Lectin סיגמא L0881-10MG EQUIPMENT 101-1000 μl כחול מדורג טיפים לפיפט ארה"ב Scentific 1111-2821 10 מ"ל Pipet מעוקר עטוף בנפרד ארה"ב Scentific 1071-0810 נפח משתנה ארגונומי (100-1000 μl) פיפטור עם מפלט קצה VWR אינטרנשיונל בע"מ 89079-974 Portable Pipet Aid, דראמונד VWR אינטרנשיונל בע"מ 53498-103 Transfer פלסטיק Pipet סטרילי VWR אינטרנשיונל בע"מ 14670-114 15 ml צינור חרוטי ארה"ב Scentific 1475-1611 מד סטרילי 18 מחטים בקטון, דיקינסון ושות' 305196 סטרילי 10 מ"ל מזרקים בקטון, דיקינסון ושות' 305482 מסנני מזרק פלסטיק קורנינג גודל נקבוביות 0,20 מיקרומטר קורנינג 431224 Acrodic 25 mm מסנן מזרק עם 5 מיקרומטר ורספור ממברנה VWR אינטרנשיונל בע"מ 28144-095 60x15 מ"מ צלחת פטרי סטרילית VWR אינטרנשיונל בע"מ 82050-548 100x15 מ"מ צלחת פטרי סטרילית VWR אינטרנשיונל בע"מ 82050-912 12 מ"מ קוטר זכוכית כיסויים VWR אינטרנשיונל בע"מ 48300-560 צלחות תרבית תאים שקופות 24 תחתונים שטוחים היטב עם מכסה תומאס סיינטיפיק 6902A09 Dumont #5- מלקחיים עדינים כלים מדעיים משובחים 11254-20 צנטריפוגה 5702 אפנדורף 22629883 Laminar Flow Hood מיקרוסקופ הפוך עם מטרה x10 אינקובטור לח אוויר