In deze video-artikel stellen we een methode voor het isoleren van een of meerdere Drosophila Da neuronen uit derde instar larven met behulp van de infrarood-capture (IR) klasse van de laser capture microdissectie (LCM). RNA verkregen uit de geïsoleerde neuronen kan gemakkelijk worden gebruikt voor downstream-toepassingen, waaronder qRT-PCR of microarray-analyses.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De dendritische arborization (da) neuronen van de Drosophila perifere zenuwstelsel (PNS) bieden een uitstekend model systeem in om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen klasse-specifieke dendriet morfogenese 1,2 onderzoeken. Ter bevordering van moleculaire analyses van de klasse-specifieke da neuron ontwikkeling, is het essentieel om deze cellen te verkrijgen in een zuivere populatie. Hoewel een waaier van verschillende cel en weefsel-specifieke RNA-isolatie technieken bestaan voor Drosophila cellen, met inbegrip magnetische bead gebaseerd cel zuivering 3,4, TL-Activated Cell Sorting (FACS) 5-8, en RNA-bindend eiwit op basis van strategieën 9, geen van deze methoden kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor het isoleren van een of meerdere klasse-specifieke Drosophila da neuronen met een hoge mate van ruimtelijke precisie. Laser capture microdissectie (LCM) is naar voren gekomen als een zeer krachtig instrument dat kan worden gebruikt om specifieke soorten cellen te isoleren uit weefsel secties met een hoge mate van ruimtelijke resolutie en nauwkeurigheid. RNA verkregen uit geïsoleerde cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor analyses waaronder qRT-PCR en microarray expressie profilering binnen een bepaald celtype 10-16. Tot op heden is LCM niet op grote schaal toegepast in de analyse van Drosophila weefsels en cellen 17,18, inclusief da neuronen in de derde instar larvale stadium van ontwikkeling.
Hier presenteren we onze geoptimaliseerd protocol voor isolatie van Drosophila da neuronen met behulp van de infrarood (IR) klasse van LCM. Deze methode zorgt voor het vastleggen van enkele, klasse-specifieke of meerdere da neuronen met een hoge specificiteit en ruimtelijke resolutie. Leeftijd gematchte derde instar larven uitdrukken van een UAS-mCD8:: GFP 19 transgen onder de controle van zowel de klasse IV da neuron specifieke ppk-GAL4 20 driver of op de pan-da neuron specifiek 21-7 GAL4-21 driver werden gebruikt voor deze experimenten. RNA verkregen uit de geïsoleerde da neuronen is van zeer hoge kwaliteit en kunnen direct worden gebruikt voor downstream toepassingen, waaronder qRT-PCR of microarray-analyses. Bovendien kan deze LCM protocol gemakkelijk worden aangepast voor het vastleggen andere Drosophila soorten cellen een verschillende stadia van ontwikkeling afhankelijk van het celtype specifieke, GAL4 gedreven expressiepatroon van GFP.
Protocol
Algemene opmerkingen over LCM van Drosophila perifere neuronen
Laat vanaf 6 uur, tot een week of langer voor het LCM, afhankelijk van het weefseltype en het aantal benodigde cellen.
Alle procedures worden uitgevoerd in strikt RNAse-vrije omstandigheden volgens standaard procedures. Larven dat zich 21-7-GAL4, UAS-mCD8:: GFP of ppk-GAL4, UAS-mCD8:: GFP transgene reporter lijnen werden gebruikt voor deze experimenten.
1. De voorbereiding van de larven
- Verzamel 30-40 leeftijd-gematchte derde instar larven en was ze in DDH 2 O gevolgd door ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol vermeld in dit document beschrijft onze geoptimaliseerde methode voor de isolatie van Drosophila perifere neuronen via LCM. Terwijl dit LCM-protocol is ontworpen voor de specifieke isolatie van enkele, klasse-specifieke of meervoudige Drosophila da neuronen uit de derde instar larvale stadium van ontwikkeling, kunnen kleine wijzigingen van het protocol gemakkelijk worden aangepast voor het vangen van andere Drosophila celtypen van alle ontwikkelings- fasen met behulp van verschill.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken Drs. Yuh-Nung Jan en Wes Grueber voor het aanbieden van vliegen voorraden gebruikt in deze studie, en Virginia Espina, dr. Emanuel Petricoin en Dr Lance Liotta voor hulp bij LCM. De auteurs erkennen de Thomas F. en Kate Miller Jeffress Memorial Trust voor de ondersteuning van dit onderzoek (DNC) en de George Mason University Provost s Office (EPRI).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
Uitrusting:
- Cryostaat
- 50 ml conische buis voor dia fixatie, spoelen, trypsine behandeling en ethanol / xyleen uitdroging
- -80 ° C vriezer
- Couveuse
- PixCell IIe LCM Instrument met Fluor 300 epifluorescentie optiek geoptimaliseerd voor EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)
Referenties
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
