استخراج الحمض النووي من مشبك الذيل: طريقة مستخدمة في التنميط الجيني لأسماك الزرد

Abstract

المصدر: Xing L., et al. التنميط الجيني السريع والفعال لأسماك الزرد باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل مع تحليل الذوبان عالي الدقة. J. Vis. Exp. (2014).

تصف هذه المقالة استخراج الحمض النووي من مشبك ذيل الزرد. يوضح البروتوكول طريقة سريعة وفعالة لتحليل الأنماط الجينية لأسماك الزرد.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. تحضير الحمض

النووي

1. تحضير المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي: 50 ملي مولار KCl ، 10 ملي Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 8.3 ، 0.3٪ توين 20 ، 0.3٪ NP40. أضف البروتيناز K الطازج إلى التركيز النهائي البالغ 1 مجم / مل في يوم الاستخدام.
2. جمع الأنسجة:
   1. لمشبك زعنفة السمك البالغ:
      1. تخدير السمك: ضع السمك في محلول MS-222 (ثلاثي الكنائين) بنسبة 0.004٪. انتظر حتى تتباطأ حركة الخياشيم.
      2. ضع السمك على كومة من 5-10 كيمويب وقطع قطعة صغيرة من زعنفة الذيل ، حوالي 2-3 مم ، بشفرة حلاقة معقمة.
      3. ضع السمكة بسرعة في خزان مكتوب عليه بالماء العذب للاسترداد ؛ قم بتسمية كل من الخزان والأنبوب المقابل الذي سيحتوي على مشبك الزعنفة بعناية. قم بتغيير الماء وإطعام الأسماك كل يومين.
      4. التقط مشبك الزعنفة بطرف ماصة معقم وانقله إلى أنبوب مملوء بمحلول تحلل الحمض النووي سعة 100 ميكرولتر.
      5. تخلص من طرف الماصة وتخلص من شفرة الحلاقة في حاوية الأدوات الحادة.
   2. لمشبك ذيل الجنين:
      1. ضع الأجنة في محلول MS-222 (tricaine) بنسبة 0.004٪. انتظر 2 دقيقة.
      2. قطع قطعة من الذيل بالملقط تحت المجهر التشريح.
      3. ضع الذيل في أنبوب مسمى مملوء بمخزن مؤقت لتحلل الحمض النووي 30 ميكرولتر.
      4. ضع الجنين بسرعة في أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر 4٪ بارافورمالدهايد.
      5. تسمية الأنابيب مع الأجنة وأنابيب الذيل المقابلة لها.
      6. قم بتخزين الأنابيب مع الأجنة عند 4 درجات مئوية طوال الليل للتثبيت.
      7. نظف الملقط باستخدام ماء Milli-Q و Kimwipes بين كل جنين لتقليل التلوث.
   3. للأجنة الكاملة:
      1. ضع الأجنة في محلول MS-222 (tricaine) بنسبة 0.004٪. انتظر 2 دقيقة.
      2. ضع 1-5 أجنة في أنبوب مملوء بمخزن مؤقت لتحلل الحمض النووي 100 ميكرولتر. الخروج ليس ضروريا.
3. هضم الحمض النووي
   احتضان الأنابيب بالأنسجة (مشابك الزعانف أو الذيل أو الأجنة) عند 55 درجة مئوية لمدة 4 ساعات حتى بين عشية وضحاها.
4. قم بتعطيل البروتيناز K
   أنابيب الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، يجب استخدام الحمض النووي لتفاعل البوليميراز المتسلسل على الفور ، أو تخزينه عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments 100 تفاعل LightScanner Master Mix بيو فاير HRLS-ASY-0002 www.biofiredx.com التريكايين بارافورمالدهيد