पूंछ क्लिप से डीएनए निष्कर्षण: एक विधि ज़ेब्राफ़िश जेनोटाइपिंग में इस्तेमाल किया

Overview

यह लेख जेब्राफिश टेल क्लिप से डीएनए निष्कर्षण का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल जेब्राफिश जीनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए एक तेजी से और कुशल विधि को दर्शाता है।

Protocol

1. डीएनए तैयारी

1. डीएनए लाइसिस बफर तैयार करें: 50 एमएमएम केसीएल, 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.3, 0.3% ट्वीन 20, 0.3% NP40। उपयोग के दिन 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता में ताजा प्रोटीन के जोड़ें।
2. ऊतक संग्रह:
   1. वयस्क मछली फिन क्लिप के लिए:
      1. एनेस्थेटाइज मछली: मछली को 0.004% एमएस-222 (ट्राइकेन) समाधान में रखें। गिल आंदोलन धीमा होने तक इंतजार करें।
      2. मछली को 5-10 किम्प्लिप्स के ढेर पर रखें और एक बाँझ रेजर ब्लेड के साथ लगभग 2-3 मिमी पूंछ फिन का एक छोटा सा टुकड़ा काट दें।
      3. जल्दी से मछली को वसूली के लिए ताजे पानी के साथ एक लेबल टैंक में रखें; ध्यान से दोनों टैंक और इसी ट्यूब है कि फिन क्लिप शामिल होंगे लेबल । पानी बदलकर हर दूसरे दिन मछली को खिलाएं।
      4. फिन क्लिप को बाँझ पिपेट टिप के साथ उठाएं और इसे 100 माइक्रोन डीएनए लाइसिस बफर से भरी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      5. पिपेट टिप को त्यागें, और रेजर ब्लेड को शार्प्स कंटेनर में छोड़ दें।
   2. भ्रूण पूंछ क्लिप के लिए:
      1. 0.004% एमएस-222 (ट्राइकेन) समाधान में भ्रूण रखें। 2 मिनट रुको।
      2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे संदंश के साथ पूंछ का एक टुकड़ा काटें।
      3. पूंछ को 30 माइक्रोन डीएनए लाइसिस बफर से भरी एक लेबल वाली ट्यूब में रखें।
      4. जल्दी से 100 माइक्रोन 4% पैराफॉर्मलडिहाइड युक्त ट्यूब में भ्रूण डाल दें।
      5. भ्रूण और उनके इसी पूंछ ट्यूबों के साथ लेबल ट्यूब।
      6. निर्धारण के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण के साथ ट्यूबों को स्टोर करें।
      7. संदूषण को कम करने के लिए प्रत्येक भ्रूण के बीच मिल्ली-क्यू पानी और किमवाइप्स का उपयोग करके संदंश को साफ करें।
   3. पूरे भ्रूण के लिए:
      1. 0.004% एमएस-222 (ट्राइकेन) समाधान में भ्रूण रखें। 2 मिनट रुको।
      2. 100 माइक्रोन डीएनए लाइसिस बफर से भरी ट्यूब में 1-5 भ्रूण डालें। डिकेरेशन जरूरी नहीं है।
3. डीएनए पाचन
   ऊतक (फिन या पूंछ क्लिप या भ्रूण) के साथ रात तक 4 घंटे तक 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ट्यूब।
4. प्रोटीनेज कश्मीर को निष्क्रिय करें
   हीट ट्यूब 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक। डीएनए का उपयोग पीसीआर के लिए तुरंत किया जाना चाहिए, या 3 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaine
Paraformaldehyde