העשרת תאי T: טכניקה לבידוד תאי T מאוכלוסיית תאים מעורבת על ידי הפרדה מגנטית

Abstract

מקור: Nguyen, H. D., et al. פלטפורמת השתלת מח עצם לחקר תפקידם של תאים דנדריטיים במחלת השתל נגד המאכסן. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מתאר העשרת תאי T מטחול העכבר על ידי ברירה שלילית באמצעות מפריד מגנטי. הטכניקה כוללת מיקוד התאים האחרים בדגימה לדלדול באמצעות נוגדנים או ליגנדים המכוונים נגד אנטיגנים ספציפיים של פני התא.

Protocol

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. יום 1: הכינו תאי T מהעכברים התורמים

1. השתמש CD45.2⁺ H2k^b+ C57BL/6 עכברים מסוג בר (WT) כתורמים עבור תאי T.
2. הרדימו עכברי C57BL/6 על ידי חנק פחמן דו חמצני (CO₂) והמתינו 2-3 דקות עד שהם מאבדים את הכרתם. בצע פריקת צוואר הרחם כהמתת חסד משנית במידת הצורך.
3. נקה את הפרווה והעור של העכבר ביסודיות עם אתנול 70%. הבלו על הטחול ובלוטות הלימפה ומפרידים אותם לתרחיף תא יחיד של טחול באמצעות בוכנה מזרק ומסננות רשת 40 מיקרומטר. שטפו את בוכנת המסננת והמזרק עם 1% סל"ד (1% FBS המכיל מדיית RPMI) כדי לאסוף את כל הטחול.
4. צנטריפוגה את מתלה התא ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. הוסף 5 מ"ל של חיץ ACK lysing (1 mM Na₂EDTA, 10 mM KHCO₃, 144 mM NH₄Cl, pH 7.2) לאחר השלכת supernatant. יש לדגור על תרחיף התא למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: חיץ ליזיס ACK משמש לשכיבה, תאי דם אדומים.
5. הוסף 5 מ"ל של 1% סל"ד כדי לעצור ליזיס. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
6. הכן מאגר מיון תאים מופעל מגנטית (MACS) קר כקרח (0.5% BSA, 2 mM EDTA ב- PBS, pH 7.2). יש להפעיל את החיץ לפני השימוש. להשעות מחדש את כדורי התא ב 5 מ"ל של מאגר MACS.
7. ספרו את הטחול ובדקו את התאים החיים והמתים באמצעות המוציטומטר וטריפאן כחול 1%. שמור aliquot של 2 x 10⁶ תאים כדי להעריך את תפוקת הטיהור עם ניתוח ציטומטריה זרימה.
8. להשעות מחדש את הטחול בריכוז של 200 x 10⁶/מ"ל במאגר MACS. הוסף 0.03 μL של ביוטין נגד עכבר-Ter-119, 0.03 μL של ביוטין נגד עכבר-CD11b, 0.03 μL של ביוטין נגד עכבר-CD45R, ו 0.03 μL של ביוטין נגד עכבר-DX5 לכל 10⁶ תאים. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C.
   הערה: ביוטין נגד עכבר-Ter-119, ביוטין נגד עכבר-CD11b, ביוטין נגד עכבר-CD45R וביוטין נגד עכבר-DX5 שימשו לתגובה עם אריתרואיד, גרנולוציטים, תאי B ותאי NK בהתאמה. לכן, תת-קבוצות תאים אלה מתרוקנות בשלב הבא.
9. הוסף 10 מ"ל של מאגר MACS קר כקרח למתלה התא. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
10. השהה מחדש את כדורי התא במאגר MACS בריכוז של 100 x 10⁶/mL. הוסף מיקרו-כדוריות אנטי-ביוטין (0.22 μL/10⁶ תאים) לתרחיף הטחול. יש לערבב היטב ולדגור במשך 15 דקות נוספות בטמפרטורה של 4°C. שטפו את מתלה התא פעם אחת עם 10 מ"ל של מאגר MACS קר כקרח. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant.
11. שים עמוד הפרדה מגנטי בשדה המגנטי. שטפו את העמוד עם 3 מ"ל של מאגר MACS. שחרר את מתלה התא על העמודה. אספו את הזרימה המורכבת מתאי T מועשרים ולא קשורים, בצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל. שטוף את עמודת MS עם 3 מ"ל של מאגר MACS קר כקרח.
    הערה: ודאו שהעמוד ריק לפני ביצוע שלבי הכביסה.
12. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשעות מחדש את גלולת התא ב 5 מ"ל של מאגר MACS.
13. ספרו את התאים ב-1% טריפאן כחול באמצעות המוציטומטר. שמור aliquot של 2 x 10⁶ תאים לבדיקת טוהר על ידי cytometry זרימה.
    הערה: התפוקה הממוצעת של תאי T ספלניים שבודדו בשיטה זו היא ~20-25 x 10⁶ תאים לעכבר.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Thermo Fisher Scienctific	11875-093	מדיה
MidiMACS	Miltenyi ביוטק	130-042-302	העשרת תאי T
0.5 מטר EDTA pH 8.0 100ML	פישר סיינטיפיק	BP2482100	מאגר MACS
10X PBS	פישר סיינטיפיק	BP3994	מאגר MACS
מיקרו-חרוזים אנטי-ביוטין	Miltenyi ביוטק	130-090-485	העשרת תאי T
נגד אדם/עכבר CD45R (B220)	תרמו פישר סיינטיפיק	13-0452-85	העשרת תאי T
ביוטין CD4 נגד עכבר	תרמו פישר סיינטיפיק	13-0041-86	העשרת תאי T
CD11b	תרמו פישר סיינטיפיק	13-0112-85	העשרת תאי T
CD25-ביוטין	תרמו פישר סיינטיפיק	13-0251-82	העשרת תאי T
CD45R	תרמו פישר סיינטיפיק	13-0452-82	העשרת תאי T
CD49b נוגדן חד-שבטי (DX5)-ביוטין	תרמו פישר סיינטיפיק	13-5971-82	העשרת תאי T
ביוטין TER-119 נגד עכבר	תרמו פישר סיינטיפיק	13-5921-85	העשרת תאי T
נגד עכבר CD45.1 PE	תרמו פישר סיינטיפיק	12-0900-83	ניתוח ציטומטריית זרימה
C57BL/6 עכברים	Charles נהר	27	תורמים/נמענים
צינורות ציטומטריה של זרימה	פישר סיינטיפיק	352008	ניתוח ציטומטריית זרימה
מסננת תאים 40 uM	תרמו פישר סיינטיפיק	22363547	הכנת תאים