来源：Huber, A. R.，等。人类血液突变负荷与克隆组成的表征。J. Vis. Exp. (2019)。
本视频介绍了从骨髓中分离造血干细胞和祖细胞（HSPCs）并使用荧光激活细胞分选技术对其进行分选的实验方案，该方法可用于获得单细胞分选的HSPCs。我们将这些分选后的细胞进行培养，以获得HSPC克隆。
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Method Article
造血干细胞与祖细胞克隆的培养与收获：一种获取单细胞分选造血干细胞与祖细胞克隆的方法
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April 30th, 2023
In This Article
Abstract
Protocol
1. HSPC 的分离、分选与培养
- 在 350 × g 条件下离心 1–2 × 107 个单个核细胞 5 分钟，弃上清，将细胞重悬于 50 μL FACS 缓冲液中。再将细胞沉淀重悬于 100 μL 抗 CD3 染色液中（抗 CD 抗体以 FACS 缓冲液按 1:100 稀释）。将细胞转移至微量离心管中。
注意：当分选细胞数量超过 >2 × 107 个时，应相应增加抗体混合液和 FACS 缓冲液的体积。 - 根据表 1中的配方配制 50 μL 2× HSC 染色混合液。
- 将 50 μL 细胞悬液与已配制的 HSC 染色混合液混合，在室温（RT）孵育 15 分钟，或在冰上孵育 1 小时，以使抗体充分结合。
- 加入 1 mL FACS 缓冲液洗涤细胞，然后在 350 × g 条件下离心 5 分钟，收集细胞沉淀。
- 将细胞重悬于 300 μL FACS 缓冲液中，并通过装有 35 µm 细胞滤网帽的 5 mL 聚苯乙烯管过滤细胞悬液，以去除细胞团块，随后进行荧光激活细胞分选（FACS）。
- 配制 25 mL HSPC 培养基，成分为含 100 ng/mL SCF、100 ng/mL Flt3、50 ng/mL TPO、10 ng/mL IL-3、20 ng/mL IL-6 和 100 ng/mL 抗生素制剂的 1× SFEM 培养基（参见材料表）。
- 向 384 孔细胞培养板的每个孔中加入 75 μL HSPC 培养基。
注意：为防止边缘孔中培养基蒸发，可在边缘孔中加入 75 μL 无菌水或 PBS，且这些孔不用于细胞分选。 - 单个 HSPC 的分选
- 根据未染色对照（单独分选的 HSC）和染色样本中的 10,000 个细胞设定 HSPC 分选门控。门控设置的代表性结果见图 1。通过在 FSC-高度与 FSC-面积散点图中圈选线性分布区域来设定单细胞门控。使用未染色对照样本设定谱系- 细胞门控。设定 CD34+ 细胞门控，并进一步通过设定 CD38- CD45RA- 细胞的特异性门控对该亚群进行表征。
- 将 384 孔板装载至 FACS 仪器上，进行单细胞分选。
注意：若 FACS 仪器支持，请开启索引分选数据记录功能，以便后续追溯已分选细胞。
- 单独分选 HSC 的培养
- 立即将 384 孔板转移至含 5% CO2 的 37 °C 恒温湿润培养箱中。
注意：为防止培养过程中培养基蒸发，应用透明聚乙烯薄膜包裹 384 孔培养板（带盖）。 - 将 384 孔板在培养箱中培养 3–4 周，直至可见克隆形成。克隆培养的代表性图像见图 2。根据起始材料的状态，约有 5%–30% 的分选细胞可发生克隆扩增。
- 立即将 384 孔板转移至含 5% CO2 的 37 °C 恒温湿润培养箱中。
| 抗体 | 体积 [μL] |
| BV421-CD34 | 5 |
| FITC-谱系混合抗体（CD3/14/19/20/56） | 5 |
| PE-CD38 | 2 |
| APC-CD90 | 0.5 |
| PerCP/Cy5.5-CD45RA | 5 |
| PE/Cy7-CD49f | 1 |
| FITC-CD16 | 1 |
| FITC-CD11b | 5 |
| FACS 缓冲液 | 25.5 |
表1：造血干细胞分选混合液。 下表列出了用于分选造血干细胞的抗体稀释比例。
2. 收获HSPC克隆
- 培养 4 周后，确定哪些孔的融合度达到 30% 或更高。
- 为每个单克隆扩增样本，预先在 1.5 mL 离心管中加入 1 mL 含 1% BSA 的 PBS，并根据对应的孔标记管子。
- 用含 1% BSA 的 PBS 预润湿移液枪头，以尽量减少细胞黏附在枪头上的数量。
- 使用 200 μL 移液器（设定体积为 75 μL）在孔中剧烈吹打培养基上下至少 5 次，并刮擦孔底以使细胞充分脱落，随后将细胞悬液收集至对应标记的离心管中。
- 吸取 75 μL 新鲜的含 1% BSA 的 PBS，重复吹打孔内残留物，以确保最大程度回收细胞。
注意： 单克隆培养的细胞可能黏附于孔底。请使用标准倒置光学显微镜检查各孔，确认所有细胞是否已被完全收集。 - 若所有融合度 >30% 的孔均已收集完毕，将 384 孔板放回培养箱继续培养。单克隆培养物可继续增殖长达 5 周。
- 将细胞悬液在 350 × g 条件下离心 5 分钟，应可见少量沉淀。
- 小心吸除上清液，仅保留约 5 μL。细胞沉淀可在 -20 °C 冻存，并可保存数月后再进行 DNA 提取。
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Results
图1：根据起始材料显示实验流程的流程图。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| CD11c FITC | BioLegend | 301603 | 克隆 3.9 |
| CD16 FITC | BioLegend | 302005 | 克隆 3G8 |
| CD3 BV650 | BioLegend | 300467 | 克隆 UCHT1 |
| CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
| CD38 PE | BioLegend | 303505 | 克隆 HIT2 |
| CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | 克隆 HI100 |
| CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | 克隆 GoH3 |
| CD90 APC | BioLegend | 328113 | 克隆 5E10 |
| 5 mL 细胞筛 | Corning | 352235 | |
| CELLSTAR 384 孔板，130 µL，F 型底，组织培养级，带盖 | Greiner | 781182 | |
| 人 Flt3 配体，高纯度级别 | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | 用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，分装为单次使用量（25 μL），浓度为 100 μg/mL |
| 人重组 IL-3（大肠杆菌表达） | Stem Cell Technologies | 78040.1 | 用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，分装为单次使用量（2.5 μL），浓度为 100 μg/mL |
| 人重组 IL-6（大肠杆菌表达） | Stem Cell Technologies | 78050.1 | 用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，分装为单次使用量（5 μL），浓度为 100 μg/mL |
| 人 SCF，高纯度级别 | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | 用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，分装为单次使用量（25 μL），浓度为 100 μg/mL |
| 人 TPO，高纯度级别 | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | 用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，分装为单次使用量（12.5 μL），浓度为 100 μg/mL |
| 谱系标记抗体（CD3/14/19/20/56）FITC | BioLegend | 348701 | 克隆：UCHT1、HCD14、HIB19、2H7、HCD56 |
| PBS | 由研究所设施配制，也可使用市售 PBS | ||
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 抗生素制剂 |
