تلطيخ الفلورسنت المناعي للكرويات: تقنية لتحليل الكرويات للتعبير عن التعبير عن المستضد داخل الخلية وخارجها

Abstract

< p class = "jove_content" >المصدر: كافاكو ، إيه سي إم وآخرون. نموذج كروي ثلاثي الأبعاد كنظام فسيولوجي أكثر لتمايز الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان والغزو في الدراسات المختبرية. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو تقنية تلطيخ الفلورسنت المناعي للكرات لفهم تمايز الخلايا الليفية أو CAFs. يساعد هذا البروتوكول في الكشف عن التعبير عن المستضدات داخل الخلية وخارجها ، بما في ذلك ترسب بروتينات ECM داخل الكرويات.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. تلطيخ الفلورسنت المناعي للفيرويدات

1. اجمع الكرات الكروية بعد حوالي 24 ساعة في أنبوب تفاعل واحد سعة 1.5 مل لكل حالة تجريبية أو لكل بروتين ليتم تحليله. على سبيل المثال ، ضع كرويات iNFs المحفزة باستخدام TGF-β1 في أنبوب مختلف عن iNFs الضابطة ، والتي لم تتم معالجتها. لتجنب تمزق الكرويات بسبب قوى القص القوية جدا ، قم بقص نهاية طرف الماصة لتكبير الفتحة. قم بتضمين ما لا يقل عن 5-10 كرويات في أنبوب تفاعل واحد ، للسماح بالتكرار ومراعاة الخسائر المحتملة أثناء خطوات الغسيل.
2. الطرد المركزي الكروية باستخدام جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء لحوالي 30-60 ثانية عند 1,000 × جم. قم بإزالة المادة الطافية المحتوية على ميثيل السليلوز بعناية عن طريق سحب العينات، دون إزعاج الكرويات المحببة.
3. يغسل ب 50 ميكرولتر من 1x PBS. كرر خطوة الطرد المركزي وقم بإزالة PBS بعناية عن طريق سحب العينات، كما هو موضح في 1.2.
4. اعتمادا على البروتين المراد تلطيخه ، قم بالتثبيت باستخدام 50 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ل αSMA و NG2 و integrin α3β1) أو مع 50 ميكرولتر من الميثانول لمدة 10 دقائق عند -20 درجة مئوية (للوحدات الفرعية Laminein-332).
5. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.3.
6. قم باختراق الخلايا بنسبة 0.1٪ Triton-X في PBS لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.3 ثلاث مرات.
8. احتضان الفيريات في PBS التي تحتوي على 5٪ FBS و 2٪ BSA ، لمدة ساعة واحدة في RT لمنع مواقع تفاعل البروتين غير المحددة.
9. احتضان الأجسام الكروية ب 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية في PBS و 2.5٪ FBS و 1٪ BSA عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: مضاد αSMA Cy-3 مترافق ومضاد ل NG2 عند 5 ميكروغرام / مل. BM2 مضاد لللامينين α3 ، 6F12 مضاد لللامينين β3 ومضاد لللامينين γ2 20 ميكروغرام / مل.
10. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.3 ثلاث مرات.
11. احتضان الأجسام الكروية ب 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية في PBS و 2.5٪ FBS و 1٪ BSA في RT لمدة 90 دقيقة. الأجسام المضادة الثانوية التالية المستخدمة هي: Alexa 488 مضاد للأرانب ومضاد للفأر (5 ميكروغرام / مل).
12. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.3 ثلاث مرات.
13. احتضان الخلايا ب 30 ميكرولتر من محلول تلطيخ DAPI لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
14. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.3.
15. ضع الكرات الكروية على شريحة زجاجية ، في قطرة من PBS ، باستخدام ماصة باستور زجاجية.
16. قم بتصوير الكرويات عن طريق المجهر الفلوري في مجهر المسح الضوئي بالليزر باستخدام تكبير 10x. خذ مقطعا عرضيا بصريا مختلفا للكروي في مستويات بصرية مختلفة من مكدس z (15-20 مستوى مكدس). لتحديد إعدادات الليزر في المجهر ، استخدم كرويا يتكون من خلايا سالبة للمستضد محل الاهتمام أو كروي ملطخ فقط بالجسم المضاد الثانوي. أعد استخدام نفس الإعدادات لجميع العينات التي ستتم مقارنتها.
17. قم بتحليل الصور المجهرية باستخدام برنامج ImageJ كما تم نشره سابقا. يتم تلخيص الخطوات في الشكل 1. كخلفية، حدد كثافة الإشارة المتكاملة لمنطقة الاهتمام الخالية من الخلايا (ROI). احسب إجمالي مضان الخلية المصححة (TCCF) على النحو التالي:
    TCCF = كثافة الإشارة المتكاملة - (مساحة الكروية المختارة × متوسط مضان الخلفية)
18. حدد إجمالي التألق المصحح (TCF) للكرات حيث تم تطبيع TCCF إلى منطقة الكروية وعدد المداخن.
    TCF = TCCF من الكرة الكروية / (مساحة الكرويات × عدد المداخن)

Results

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. خطوات متسلسلة للقياس الكمي للتلطيخ المناعي الفلوري لبروتين ذي أهمية في الكرويات ، باستخدام ImageJ. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments 4',6-Diamidino-2-فينيليندول, ثنائي هيدروكلوريد (DAPI) سيجما ألدريتش د9542-10 6F12 ماوس الوحدة الفرعية β3 المضادة لللامينين (أحادية النسيلة) محلي الصنع جزء الألبومين الخامس - BSA AppliChem أ 1391 أليكسا فلور 488 الماعز (متعدد النسيلة) مضاد للفأر إنفيتروجين أ 11029 أليكسا فلور 488 أرنب الماعز (متعدد النسيلة) إنفيتروجين أ 11034 ماوس الوحدة الفرعية المضادة لللامينين γ2 (أحادي النسيلة) سانتا كروز SC-28330 جهاز الطرد المركزي مقاعد البدلاء فيشر ساينتيك 50-589-620 نبت BM2 الوحدة الفرعية المضادة لللامينين α3 (أحادية النسيلة) تفضل بتقديم البروفيسور باتريشيا روسيل ، CNRS ، ليون أنابيب الطرد المركزي 50 مل كورنينج هاتف: 430290 مجهر متحد البؤر زييس DMEM (ارتفاع نسبة الجلوكوز 4.5 جم / لتر) لونزا BE12-604F الخلايا الليفية البنكرياسية الأولية البشرية بيلوبيوتيك PB-H-6201 البنسلين / الستربتومايسين جيبكو 15140-122 شرائح المجهر الترمو: العلمية J1800AMNZ بارافورمالدهيد ريدل دي هاين 16005 تريتونإكس-100 سيجما ألدريتش إكس 100 آر إس