Tinción inmunofluorescente de esferoides: una técnica para analizar la expresión de esferoides para la expresión de antígenos intra y extracelulares

Abstract

Fuente: Cavaco, A. C. M. et al. Un modelo de esferoide 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación e invasión de fibroblastos asociados al cáncer en estudios in vitro. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe la técnica de tinción inmunofluorescente de esferoides para comprender la diferenciación de los fibroblastos o CAFs. Este protocolo ayuda a detectar la expresión de antígenos intracelulares y extracelulares, incluido el depósito de proteínas ECM dentro de los esferoides.

Protocol

1. Tinción inmunofluorescente de esferoides

1. Recoja los esferoides después de aproximadamente 24 h en un tubo de reacción de 1,5 mL por condición experimental o por proteína a analizar. Por ejemplo, colocar los esferoides de las iNFs estimuladas con TGF-β1 en un tubo diferente a las iNFs de control, que no fueron tratadas. Para evitar la ruptura de los esferoides debido a fuerzas de cizallamiento demasiado fuertes, corte el extremo de la punta de la pipeta para agrandar el orificio. Incluya al menos 5-10 esferoides en un tubo de reacción, para permitir réplicas y tener en cuenta las posibles pérdidas durante las etapas de lavado.
2. Centrifugar los e....

Results

Figura 1. Pasos secuenciales para la cuantificación de la tinción inmunofluorescente de una proteína de interés en esferoides, utilizando ImageJ. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato (DAPI)	SIGMA-ALDRICH	D9542-10
6F12 anti-Laminina β3 subunidad Ratón (monoclonal)			casero
Fracción V de Albúmina - BSA	AppliChem	A1391
Alexa fluor 488 Cabra (policlonal) anti-Ratón	Invitrogen	A11029
Alexa fluor 488 Cabra (policlonal) Conejo	Invitrogen	A11034
Anti-laminina γ2 subunidad Ratón (monoclonal)	Santa Cruz	SC-28330
Centrífuga de banco	Fisher Científico	50-589-620	retoño
BM2 anti-laminina α3 subunidad Ratón (monoclonal)			Amablemente proporcionado por la Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Tubos de centrífuga 50 mL	Corning	430290
Microscopio confocal	Zeiss
DMEM (glucosa alta 4,5 g/L)	Lonza	BE12-604F
Fibroblastos pancreáticos primarios humanos	PELOBiotech	PB-H-6201
Penicilina/estreptomicina	Gibco	Números 15140-122
Portaobjetos de microscopio	Termo Científico	J1800AMNZ
Paraformaldehido	Riedel-de Haën	Año 16005
TritonX-100	SIGMA-ALDRICH	X100RS