Etablera primärkulturer Vuxen Fibroblast från gnagare
Summary
Denna artikel beskriver ett protokoll för isolering och underhåll av primära fibroblast kulturer från hud och lungvävnad hos vilda gnagare.
Abstract
Vikten av att använda galvaniska element, snarare än cancer cellinjer, för biologiska studier blir allmänt erkänd. Primärceller är att föredra i studier av kontrollen av cellcykeln, apoptos, och DNA-reparation, som cancerceller bär mutationer i gener som är inblandade i dessa processer. Primärceller kan inte odlas på obestämd tid på grund av uppkomsten av replikationsförmåga åldrande eller aneuploidization. Därför, nya kulturer måste fastställas regelbundet. Förfarandet för isolering av gnagare embryonala fibroblaster är väl etablerad, men isolera vuxna fibroblast kulturer ofta en utmaning. Vuxen gnagare fibroblaster isolerade från musmodeller för mänskliga sjukdomar kan vara en god kontroll man jämför dem med fibroblaster från mänskliga patienter. Dessutom vuxna fibroblaster är den enda tillgängliga materialet när man arbetar med vilda gnagare där dräktiga honor inte enkelt kan erhållas. Här ger vi ett protokoll för isolering och odling av vuxna fibroblaster från gnagare hud och lungor. Vi använde den här proceduren framgångsrikt att isolera fibroblaster från över tjugo gnagare från laboratorie-möss och råttor till vilda gnagare som bäver, piggsvin och ekorre.
Protocol
Discussion
Normal primära fibroblaster ger ett utmärkt alternativ till etablerade cancercellinjer i biologisk forskning. En viktig fördel med fibroblaster är att de inte bär på mutationer i onkogener och tumör stötvågsfilter och bibehålla intakt checkpoints cellcykeln. Detta gör normala fibroblaster en önskad system för studier av cellcykeln reglering, DNA-reparation, och apoptos. Protokollet som beskrivs här är ett enkelt recept för isolering och underhåll av primära fibroblaster. Detta protokoll har använts f?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Steven Austad för att förse oss med den första versionen av detta protokoll. Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH och Ellison Medical Foundation till VG och AS
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM/F12 media | Invitrogen | 11330-032 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Invitrogen | 01437-036 | The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts. | |
| Antibiotic/Antimycotic | Invitrogen | 15420-096 | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05401127001 | Replacement enzyme. | |
| A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 – 10 mg, Cat. no. 05401127001 – 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues. | ||||
| EMEM media | ATCC | 30-203 | The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate. | |
| Feathered #21 disposable, sterile scalpel | Multiple suppliers | |||
| Three Gas Control incubator | Forma or Heraeus |
References
- Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
- Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).
