Visualizing एचआईवी के स्थानांतरण सेल के लिए सेल एचआईवी और लाइव confocal माइक्रोस्कोपी के प्रतिदीप्त क्लोन का उपयोग

Summary

यह कल्पना प्रयोग एचआईवी के रहते confocal इमेजिंग प्रयोगों के लिए एक फ्लोरोसेंट आणविक क्लोन का उपयोग करने के लिए एक गाइड है.

Abstract

अपने पसंदीदा प्रोटीन के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन fusing, जीव अब जटिल सेलुलर प्रतिदीप्ति वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रक्रियाओं रह अध्ययन करने की क्षमता है. सेल करने वाली सेल मानव इम्यूनो वायरस के ट्रांसमिशन के दौरान मानव इम्यूनो वायरस कोर प्रोटीन की गतिविधियों पर नज़र रखने के लिए, हम एचआईवी के एक संक्रामक आणविक क्लोन के संदर्भ में चुप प्रोटीन, एचआईवी चुप – iGFP बुलाया GFP टैग. हम इस वायरल वीडियो confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग क्लोन अध्ययन. निम्नलिखित कल्पना प्रयोग में, हम चुप – iGFP एचआईवी के साथ एक मानव टी सेल लाइन transfect, और हम fluorescently लेबल असंक्रमित सीडी 4 + टी कोशिकाओं को वायरस के लिए लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में सेवा का उपयोग करें. विभिन्न फ्लोरोसेंट लेबल हम कहनेवाला संरचनाओं के पार आसानी से वायरल उत्पादन और परिवहन का पालन कर सकते हैं का प्रयोग virological synapses बुलाया. सरल गैस पारगम्य इमेजिंग कक्षों हमें दिनों मिनट से जीना confocal माइक्रोस्कोपी के साथ synapses निरीक्षण करने के लिए अनुमति देते हैं. इन तरीकों वायरल प्रोटीन को ट्रैक के रूप में वे एक कक्ष से अगले कदम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

इस विधि में रिपोर्ट अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया था Hübner एट अल विज्ञान 323: 1743-1747 (2009) . 1. अवलोकन सेल के लिए सेल एचआईवी के प्रसार के मूल दाता कोशिकाओं और प्राथमिक सीडी 4 + स्वीकर्ता 1,2,3 कोशिकाओं के रूप में टी lymphocytes के रूप में एचआईवी संक्रमित Jurkat कोशिकाओं का उपयोग वर्णित किया गया था. इन अध्ययनों में, वायरस तय एंटीबॉडी धुंधला का उपयोग कर कक्षों में खोजा गया था. कक्ष से जीवित कोशिकाओं में वायरस के सेल करने के लिए स्थानांतरण को ट्रैक करने के लिए, हम एक पुनः संयोजक, एचआईवी के संक्रामक आणविक क्लोन एचआईवी चुप – iGFP 4 कहा जाता है शोषण. यह हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) एमए और सीए डोमेन के बीच झूठ प्रोटीन में आंतरिक सम्मिलित किया जाता है. एचआईवी का यह आणविक क्लोन सहायक वायरस के लिए की आवश्यकता के बिना संक्रामकता बरकरार रखती है. इस क्लोन से बना वायरस कणों stoichiometrically हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लोड कर रहे हैं, एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत करने के लिए वायरल और कोशिकाओं के बीच विधानसभा हस्तांतरण की निगरानी प्रदान करते हैं. जब साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया निष्क्रिय सेल ट्रैकिंग फ्लोरोसेंट रंजक, प्राप्तकर्ता कोशिकाओं इनपुट दाता कोशिकाओं से भेदभाव किया जा सकता है, और एक एक संक्रमित टी सेल से एक असंक्रमित टी 5 सेल एचआईवी के हस्तांतरण कल्पना करने के लिए अनुमति देता है. Virological synapse गठन और वायरस के एक कक्ष से दूसरे में स्थानांतरित फिर जीवित कोशिकाओं में मनाया जा सकता है, जबकि वे एक मोहरबंद, गैस पारगम्य इमेजिंग कक्ष में सुसंस्कृत हैं. (दिवस 1) 2. चुप – iGFP एचआईवी की तैयारी Jurkat टी कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट ध्यान से 2 एक्स 10 5 और 8 10 5 कोशिकाओं / एमएल में Jurkat संस्कृति मीडिया (1640 RPMI, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम एक्स के बीच एक एकाग्रता में कोशिकाओं को बनाए रखने के द्वारा मानव सीडी 4 + टी सेल लाइन Jurkat (ATCC, Manassas, VA) तैयार, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, और 100 स्ट्रेप्टोमाइसिन μg एमएल /). सफलता की कुंजी: 8 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल से अधिक सांद्रता में Jurkat कोशिकाओं के संस्कृति अभिकर्मक दक्षता में कमी में परिणाम होगा. नोट: टी कोशिकाओं में एचआईवी चुप iGFP proviral डीएनए, नीचे के रूप में वर्णित है, एक प्रतिकृति – सक्षम मानव इम्यूनो वायरस के उत्पादन में परिणाम के अभिकर्मक. जैसे, सभी प्रक्रियाओं प्रमाणित जैव सुरक्षा स्तर 2 + या जैव सुरक्षा स्तर 3 (+ / BL2 BL3) टिशू कल्चर कमरे में केवल प्रशिक्षित प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा किए जा रहे हैं. संक्रामक एचआईवी के साथ कार्य इमेजिंग सुविधाओं में अपने स्थानीय संस्थागत जैव सुरक्षा कार्यालय द्वारा अनुमोदित होना चाहिए. वायरल प्लाज्मिड एचआईवी Amaxa nucleofection विधि (Lonza, Walkersville, एमडी) का उपयोग करते हुए चुप – iGFP साथ Jurkats transfect. गोली 5 x 10 6 10 मिनट के लिए 150 पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं एक्स जी सतह पर तैरनेवाला Aspirate और बाँझ फॉस्फेट में कोशिकाओं धोने buffered खारा (पीबीएस). अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और पूर्व गर्म, nucleofector समाधान निर्माता पूरक युक्त वी के 97 μL गोली resuspend. सेल निलंबन endotoxin मुक्त चुप iGFP एचआईवी प्लाज्मिड (1 μg / μL) के तीन μL जोड़ें और मिश्रण धीरे. एक क्युवेट और nucleofect सेल निलंबन स्थानांतरण S-18 प्रोग्राम का उपयोग. तुरंत एंटीबायोटिक दवाओं के बिना prewarmed Jurkat संस्कृति मीडिया के 3 एमएल कोशिकाओं हस्तांतरण. Virological synapses के लिए सीडी 4 + लक्ष्य कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, हम एक मानक प्रोटोकॉल है Ficoll Paque (जीई हेल्थकेयर, अपसला, स्वीडन) का उपयोग करके मानव buffy कोट से परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear को प्राप्त करते हैं. सीडी 4 + टी कोशिकाओं नकारात्मक हैं तो एक चुंबकीय मनका अलगाव किट (Miltenyi बायोटेक, Auburn, सीए) का उपयोग कर चुना. ये cryogenically x 5 ठंड मीडिया की 6 10 cells/500 μL (90% भ्रूण गोजातीय serum/10% DMSO) के aliquots में तरल N2 में संग्रहीत किया जा सकता है. Thawed प्राथमिक सीडी 4 + टी कोशिकाओं RPMI 10% FBS, आईएल -2 के 10 इकाइयों / एमएल के साथ पूरक में सुसंस्कृत हैं. (दिवस 2) 3. चुप iGFP एचआईवी और लक्ष्य कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट रंजक के साथ धुंधला के साथ ट्रांसफ़ेक्ट Jurkats से लाइव कक्ष की वसूली Jurkat कोशिकाओं अभिकर्मक से ठीक करने के लिए रातोंरात की अनुमति दें. फिर ficoll hypaque घनत्व ढाल सामग्री पर centrifugation द्वारा सेलुलर मलबे को हटा दें. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के नीचे करने के लिए Ficoll – Paque 1.5 एमएल बग़ैर. धीरे RPMI के 5 एमएल मात्रा में ट्रांसफ़ेक्ट Jurkats के साथ इस ढाल सामग्री उपरिशायी. ब्रेक बंद के साथ कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 400 XG में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. ध्यान से मीडिया / Ficoll एक विंदुक का उपयोग कर अंतरफलक से कोशिकाओं को हटाने. उन्हें एक नया 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर स्थानांतरण. 10 मिनट के लिए 300 XG पर 15 एमएल और अपकेंद्रित्र की कुल मात्रा RMPI के साथ कोशिकाओं पतला. एक अच्छी तरह से 2 सेमी (6 अच्छी तरह से थाली) में 3 Jurkat संस्कृति मीडिया की एमएल में गोली Resuspend और टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं वापसी. सेल सेल हस्तांतरण प्रयोगों में दाता कोशिकाओं से लक्ष्य कोशिकाओं भेद हम सीडी 4 prelabel + फ्लोरोसेंट रंजक के साथ लक्ष्य की कोशिकाओं. प्राथमिक सीडी 4 + टी कोशिकाओं को भी चिह्नित कर रहे हैंउपयोग करने से पहले हैं. हम दोनों CellTracker और CellTrace रंजक (Invitrogen, Carlsbad, CA) के साथ उत्कृष्ट सफलता लेबलिंग टी कोशिकाओं पड़ा है. जबकि डाई एकाग्रता और ऊष्मायन बार विशेष डाई और सेल इस्तेमाल किया प्रकार के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए, एक प्रतिनिधि प्रोटोकॉल के बाद. गोली 4 x 10 6 प्राथमिक सीडी 4 + टी कोशिकाओं के 10 मिनट के लिए 400 XG पर कताई द्वारा . पीबीएस के 2 एमएल में 5 एमएल पीबीएस और resuspend के साथ कोशिकाओं को धो लें. 1.5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता CellTracker ऑरेंज (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) जोड़ें और 37 पर सेते ° C 20 मिनट के लिए. पूरा Jurkat मीडिया के 8 एमएल जोड़ें और 10 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र. 10 आईएल-2 / एमएल और टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रातोंरात जगह इकाइयों के साथ पूरक पूरा मीडिया के 3 एमएल में कोशिकाओं Resuspend. (3 दिन) 4. मॉनिटरिंग सेल के लिए सेल एचआईवी के स्थानांतरण चुप iGFP लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग हम नियमित एचआईवी चुप iGFP ट्रांसफ़ेक्ट Jurkat कोशिकाओं को 48 के बाद अभिकर्मक घंटे का उपयोग करें. हालांकि, हम सफलतापूर्वक 24 घंटे के रूप में जल्दी के रूप में कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है, और के रूप में 72 के बाद अभिकर्मक घंटे के रूप में देर है. लगभग 48 घंटे बाद अभिकर्मक, एचआईवी चुप – iGFP व्यक्त Jurkats गिना रहे हैं, सीओ 2 के साथ धोया स्वतंत्र मीडिया (Invitrogen, Carlsbad, CA), और जीना सेल इमेजिंग मीडिया (सीओ 2 स्वतंत्र मीडिया, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम में resuspended, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 / μg एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 इकाइयों / एमएल आईएल -2 1-3 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में). इसी तरह फैशन में धो लें, और 1-3 10 x 7 कोशिकाओं / लाइव सेल इमेजिंग मीडिया में एमएल के एक एकाग्रता में लेबल प्राथमिक सीडी 4 + टी कोशिकाओं resuspend . मिक्स एचआईवी प्राथमिक सीडी 4 + एक 1:02 या 1:03 और एक ऊतक इलाज संस्कृति, गैस पारगम्य microchamber (Ibidi, वेरोना, WI) में अनुपात लोड पर टी कोशिकाओं के साथ चुप – iGFP ट्रांसफ़ेक्ट Jurkats. उदाहरण के लिए, लेबल प्राथमिक सीडी 4 + टी कोशिकाओं की 40 μL के साथ एचआईवी चुप – iGFP ट्रांसफ़ेक्ट Jurkats 20 μL मिश्रण. एक Ibidi चेंबर में इस मिश्रण की 50 μL लोड और प्लग के साथ चैम्बर मुहर. Parafilm के साथ प्लग / Ibidi कक्ष अंतरफलक लपेटकर द्वारा सुरक्षित प्लग. 5. माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्मों के लिए बातें: कताई डिस्क confocal इमेजिंग कोशिकाओं के साथ एक Ibidi इमेजिंग चैम्बर लोड करने के बाद, हम तुरंत एक औंधा ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (iX71 ओलिंप, केंद्र घाटी, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) पर डिवाइस माउंट. Ibidi चैम्बर BL2 + प्रशिक्षित प्रयोगशाला उपयुक्त सुरक्षा वस्त्र पहने कर्मियों द्वारा केवल माइक्रोस्कोप के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए. हालांकि रहने कक्ष इमेजिंग आमतौर पर महंगी ऊष्मायन कक्षों का उपयोग करता है एक स्थिर 37 डिग्री सेल्सियस वातावरण बनाए रखने के लिए, यह एक टी प्रकार thermocouple टिप के साथ एक सरल और किफायती थर्मास्टाटिक हीटर (400 एएसआई, Nevtek, Williamsville, VA) का प्रयोग कर प्राप्त किया गया था अगले घुड़सवार उचित तापमान प्रतिक्रिया के लिए नमूना. हम सीओ का उपयोग कर पाया है 2 स्वतंत्र मीडिया हमें उच्च सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए, जबकि एक सीओ 2 चैम्बर के प्रयोग से परहेज करने की अनुमति देता है. कमरे में तापमान के उतार चढ़ाव के खिलाफ मंच बफर और पृष्ठभूमि कमरे प्रकाश बाहर ब्लॉक करने के लिए, एक बड़े काले कफन पूरे माइक्रोस्कोप / हीटर प्रणाली के चारों ओर एक अछूता हवा जेब बनाने सेटअप पर लिपटी है. यह बहुत तापमान परिवर्तन और संबद्ध तापमान से संबंधित नमूना बहाव को कम कर देता है, लेकिन नमूना बढ़ते से पहले 30 मिनट के लिए पूर्व हीटिंग की आवश्यकता है. 6. डाटा अधिग्रहण, स्थानांतरण, और छवि प्रसंस्करण छवियाँ उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) बहुत संकल्प में सुधार के रूप में एक 60x एनए 1.42 तेल विसर्जन उद्देश्य (UPlanApo एन, ओलिंप) का उपयोग कर लिया जाता है. 3D confocal छवियों बनाने के लिए, स्कैनिंग एक कताई डिस्क confocal (CSU 10, Yokagawa, जापान) इकाई है कि एक साथ> 800 confocal स्पॉट का उपयोग करता है करने के लिए नाटकीय रूप से स्कैन की दर में वृद्धि के द्वारा किया जाता है. अपनी गति, CSU-10 एक बेहद संवेदनशील इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज युग्मित डिवाइस (EMCCD + 897 iXon, Andor टेक्नोलॉजीज, आयरलैंड) कैमरे के लिए तेजी से, कम रोशनी इमेजिंग जो दोनों photobleaching और phototoxicity कम कर देता है की अनुमति के साथ बनती है. तारीफ करने प्रकाश प्रतिदीप्ति स्रोत बहु तरंगदैर्ध्य ArKr आयन गैस लेजर (इनोवा 70C, सुसंगत, सांता क्लारा) जहां वांछित तरंग दैर्ध्य (488 एनएम) और लेजर शक्ति माइक्रोस्कोप उद्देश्य (<1 मेगावाट) से पहले सही मापा द्वारा चयनित acousto ऑप्टिक tunable (AOTF) फिल्टर, (Andor टेक्नोलॉजीज). आगे photobleaching कम और कुल इमेजिंग समय का विस्तार तेजी से AOTF (microseconds) लेजर बीम से हर बार कैमरे निष्क्रिय है (10-20 एमएस) जबकि नये अधिग्रहीत छवि सीसीडी (15-30 एमएस जोखिम) से वितरित किया जाता है बन्द हो जाता है कंप्यूटर के लिए. लेसर प्रकाश कताई डिस्क का उपयोग कर प्रणाली एक 405/488/568/647 ट्रैक्टर बैंड dichroic दर्पण (Semrock, Rochester, NY) में युग्मित है. प्रतिदीप्ति उत्सर्जन (Ludl इलेक्ट्रॉनिक उत्पाद, Hawthorne, NY) एक फिल्टर पहिया के अंदर एक 525/50 bandpass फिल्टर (Semrock) का उपयोग फ़िल्टर्ड है घुड़सवार खEMCCD कैमरा और confocal कताई डिस्क इकाई etween. सभी हार्डवेयर और अधिग्रहण, z-मंच (पागल सिटी लैब्स, मैडिसन, WI) सहित, Andor बुद्धि v1.8 सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. 1.2-1.9 के आसपास दूसरे 3D छवि के ढेर पर अधिग्रहण की गति को अधिकतम करने के लिए, हम नीचे सेल जोड़ी के तत्काल क्षेत्र में EMCCD कैमरे की रिकॉर्डिंग क्षेत्र फसल. इसके अलावा, Z में कुछ जानकारी की कीमत 0.45-0.75 सुक्ष्ममापी के बीच एक बड़े z कदम अप करने के लिए अधिग्रहण की गति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन शर्तों के तहत इमेजिंग 6 घंटे के लिए पिछले कर सकते हैं – सतत 20-60 मिनट के क्षेत्रों का उपयोग कर – न्यूनतम photobleaching के साथ. कुल मिलाकर, प्रत्येक डेटा खंड आम तौर पर अंतरिक्ष के रूप में छवियों के हजारों के दसियों ले रहे हैं के 5-20 जीबी रह रहे हैं. परिवहन और बड़े डेटा फ़ाइलों के विश्लेषण की सुविधा के लिए, प्रत्येक अधिग्रहण सेट नीचे टूटी हुई है हो सकता है और 1 जीबी झगड़ा छवि फ़ाइल क्षेत्रों Andor बुद्धि v1.8 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के रूप में निर्यात की जरूरत है. यहाँ से, कई उत्कृष्ट सॉफ्टवेयर संकुल Metamorph Volocity, और ImageJ (हम अपनी भिन्नता फिजी की सिफारिश) के रूप में छवि विश्लेषण के लिए उपलब्ध हैं. जब दो फ्लोरोसेंट मार्करों के लिए लगाया जा रहे हैं, हम एक साथ एक का उपयोग करके नीचे धीमा अधिग्रहण के बिना उन दोनों के रिकॉर्ड "विभाजित स्क्रीन मोड." दोनों मार्करों एक बार में दो अलग ArKr लेजर लाइनें (अक्सर 488 और 568 एनएम) के द्वारा उत्साहित कर रहे हैं. सीधे सम्मिलित पहले EMCCD कैमरा एक छवि (OptoSplit द्वितीय, केयर्न, केंट, ब्रिटेन) फाड़नेवाला है कि दो अलग छवियों को अलग है. प्रत्येक छवि तो स्वतंत्र है एक बार "विभाजित स्क्रीन" प्रभाव बनाने में कैमरे पर प्रतिदीप्ति (Semrock) फिल्टर और अनुमान पक्ष द्वारा साइड का उपयोग करने के लिए फ़िल्टर. यह तो पुस्तिका फसल और छवियों के बाद में छवि प्रसंस्करण में aligning की आवश्यकता होगी. 7. छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण के लिए विचार हम आम तौर पर Macintosh कंप्यूटर पर Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) (एप्पल इंक) के साथ छवि विश्लेषण करते हैं. स्पिनिंग डिस्क लेजर confocal माइक्रोस्कोपी छवियों को पहली बार उनकी तीव्रता में समायोजित कर रहे हैं photobleaching, तो Volocity साथ deconvolved के लिए सही है. चुप puncta की तीव्रता माप और ट्रैकिंग Volocity मात्रा मॉड्यूल के साथ किया जाता है. छवि सेट जहां पूर्व गठित एक synapse रिश्तेदार आंदोलन करने के लिए गणना की जरूरत है, एक स्वचालित ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म कार्यरत है जो पूरे अनुक्रम भर synaptic बटन पटरियों. पुष्टि करने के लिए है कि सॉफ्टवेयर सही ढंग से वांछित वस्तु पर नज़र रखी है autotracking सॉफ्टवेयर द्वारा परिभाषित हित के क्षेत्रों के मैनुअल निरीक्षण किया जाना चाहिए. वस्तुओं के लिए जहां आसपास के वस्तुओं के साथ इसके विपरीत भी कमजोर है के लिए, पुस्तिका ट्रैकिंग द्वारा फ्रेम एक फ्रेम के आधार पर निष्पादित किया जा सकता है. Volocity सॉफ्टवेयर पैकेज XYZ स्थान, मात्रा और इच्छित वस्तुओं के भीतर एकीकृत संकेत के निर्यात की अनुमति देता है. synapse और ट्रैक किए गए ऑब्जेक्ट के वेग से दूरी synaptic बटन के केंद्र के लिए सामान्य आंदोलनों के द्वारा की गणना कर रहे हैं. 8. प्रतिनिधि परिणाम मिश्रण के 10 से 15 मिनट के भीतर एक एचआईवी – चुप iGFP व्यक्त Jurkat प्राथमिक सीडी 4 का पालन कोशिकाओं + टी कोशिकाओं की कल्पना करने में सक्षम होना चाहिए. इमेजिंग इन conjugates, एक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से synaspe बाद लक्ष्य कोशिकाओं में संक्रमित कोशिकाओं में चुप puncta के आंदोलनों का आकलन कर सकते हैं. एक लक्ष्य कोशिकाओं में चुप – iGFP puncta के आंदोलन जल्द ही निरीक्षण के बाद synapses के गठन कर रहे हैं हो सकता है.

Discussion

हम यहाँ सेल सेल से एचआईवी के हस्तांतरण visualizing के लिए एक सरल विधि का वर्णन. हमारी प्रयोगशाला और दूसरों से हाल के शोध से पता चलता है कि इस टी कोशिकाओं के बीच फैल एचआईवी के प्रमुख विधा किया जा सकता है. विधि यहाँ वर्णित एचआईवी की एक रीकॉम्बीनैंट फार्म रोजगार, एचआईवी चुप iGFP, जो एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कोर संरचनात्मक प्रोटीन झूठ, में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग किया जाता है बुलाया. GFP के उच्च स्तर के प्रत्येक वायरस कण में उत्पादित की वजह से, इस क्लोन प्रतिकृति – सक्षम एचआईवी के शोधकर्ताओं करने के लिए सक्षम बनाता है वास्तविक समय में अलग – अलग वायरस कणों को ट्रैक. यह वायरस विधानसभा और सेल सेल एचआईवी के हस्तांतरण से संबंधित अध्ययन में विशेष रूप से उपयोगी होना चाहिए.

सेल सेल हस्तांतरण द्वारा एचआईवी के हस्तांतरण अत्यधिक कुशल है. एक तीन घंटे के दौरान सह संस्कृति, हम दिनचर्या को देखने के वायरस प्राथमिक टी कोशिकाओं की 20-30% करने के लिए हस्तांतरित के रूप में प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन. इसी तरह के क्षमता गुणात्मक जीना सेल इमेजिंग के दौरान देखा जाता है. Virally संक्रमित टी कोशिकाओं असंक्रमित सह संस्कृति की दीक्षा के बाद लगभग तुरंत प्राथमिक टी कोशिकाओं के साथ synapses गठन शुरू करते हैं. दिलचस्प है, प्राथमिक टी नहीं सभी कोशिकाओं लेजर चिमटी (अप्रकाशित टिप्पणियों, जीएम) के साथ मजबूर बातचीत के बावजूद एचआईवी संक्रमित Jurkat कोशिकाओं के साथ बातचीत करने में सक्षम हैं. चुप – iGFP एचआईवी निस्संदेह टी सेल सबसेट है कि सबसे करने के लिए स्थानांतरण सेल सेल, दोनों इन विट्रो में और vivo में करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं निर्धारित करने के लिए उपयोगी हो जाएगा.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Jurkat T Cells		ATCC
Leukocyte buffy coats from whole blood		New York Blood Center
RPMI		Sigma
Fetal Bovine Serum		Hyclone
Penicillin/Streptomycin		Invitrogen
Nucleofector System and Solution V		Lonza
EndoFree Maxi Prep Kits		Qiagen
HIV Gag-iGFP plasmid		Chen Laboratory
CD4+ T Cell Isolation Kit		Miltenyi Biotec
Ficoll-Paque		GE Healthcare
Celltracker/CellTrace Dyes		Invitrogen
CO2-Independent Media		Invitrogen
Imaging Chambers		Ibidi
Olympus IX-71 Inverted Microscope		Olympus
PlanApo N 1.42NA 60X oil objective		Olympus
Innova 70C ArKr ion gas laser		Coherent
CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit		Yokogawa
Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter		Semrock
525/50 bandpass filter		Semrock
iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera		Andor
ASI 400 Thermostatic Heater		Nevtek