الكميات بؤر γH2AX في عينات الأنسجة
Summary
لقد أصبح من الكميات فواصل المزدوج حبلا الحمض النووي على أساس من بؤر γH2AX أداة لا تقدر بثمن ، لا سيما في مجال البيولوجيا الإشعاعية ، لتقييم حساسية للأشعة الأنسجة وآثار الاشعاع تعديل المركبات. نحن هنا لشرح استخدام للمقايسة التألق المناعي عن الكميات من بؤر γH2AX في عينات الأنسجة.
Abstract
الحمض النووي مزدوج الجديلة (DSBs) هي آفات فتاكة بشكل خاص وسام للجينات ، التي يمكن أن تنشأ إما عن طريق عمليات داخلية (فسيولوجية أو مرضية) أو بفعل عوامل خارجية ، وخاصة الإشعاعات المؤينة والمركبات محاك للإشعاع. الفسفرة من البديل H2A هيستون ، H2AX ، على بقايا سيرين 139 ، في غاية الحفظ عزر SQEY C – المحطة ، وتشكيل γH2AX ، هو الاستجابة المبكرة لالحمض النووي المزدوج الجديلة<sup> 1</sup>. وتتوسط هذا الحدث من قبل الفسفرة فسفاتيديل inosito – 3 – كيناز (PI3K) عائلة من البروتينات ، رنح توسع الشعيرات تحور (ATM) ، الوحيدات كيناز الحمض النووي من البروتين المحفز وأجهزة الصراف الآلي وRAD3 ذات الصلة (ATR)<sup> 2</sup>. عموما ، نتائج التوجيهي DSB في تشكيل بؤر منفصلة γH2AX النووية التي يمكن الكشف عنها بسهولة وquantitated بواسطة المجهر المناعي<sup> 2</sup>. نظرا لخصوصية فريدة وحساسية هذه العلامة ، وتحليل بؤر γH2AX أدى إلى طائفة واسعة من التطبيقات في مجال البحوث الطبية الحيوية ، وبخاصة في مجال البيولوجيا الإشعاعية والطب النووي. كانت الكميات من بؤر γH2AX التحقيق على نطاق واسع في معظم نظم زراعة الخلايا في سياق DSBs المستحثة بالإشعاع المؤين. وبصرف النظر عن حساسية للأشعة الخلوية ، كما تم بناء المقايسات المناعي المستخدمة لتقييم فعالية الإشعاع تعديل المركبات. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام γH2AX كعلامة الجزيئية لدراسة فعالية مركبات DSB الذي يحفز مختلف ، وآخرها كما بشرت علامة هامة للتقدم في السن والمرض ، وبصفة خاصة السرطان<sup> 3</sup>. وقد تم تكييف مزيد من التألق المناعي القائم على أساليب للكشف وتناسب الكميات من بؤر γH2AX<em> خارج الحي</em> و<em> في الجسم الحي</em<sup> 4،5</sup>. هنا ، علينا أن نظهر طريقة نموذجية المناعي للكشف عن الكميات وبؤر γH2AX في الأنسجة الماوس.
Protocol
Discussion
لغرض هذه المظاهرة كنا الماوس أنسجة الرئة من دون علاج BALB / ج والفئران من نموذج الفأر من مرض مزمن في الشعب الهوائية التحسسي. quantitated نحن اختلافات في عدد من البؤر في زنزانة مع المعدلات أعلى قليلا لوحظت في الرئة مقارنة المقاطع التالفة دون علاج. على وجه التحديد ، أشار الكميا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ومن المسلم به بدعم من المعهد الأسترالي للعلوم والهندسة النووية. وكان TCK المستلم من الجوائز AINSE. يتم اعتماد مختبر الطب التي Epigenomic الوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية في استراليا (566559). ويدعم LM عن طريق البحث في ملبورن (جامعة ملبورن) والمنح الطبية التكميلية لجنة حقوق الطفل التصوير. وبدعم من جامعة موناش مايكرو التصوير (الدكاترة ستيفن كودي وكارمايكل Iśka) لا تقدر بثمن لهذا العمل. MMT تشعر بالامتنان للمساعدة والمشورة من الخبراء الدكتورة أولغا Sedelnikova من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Gläser, Germany | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, USA | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen, USA | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
