1. Instrument och kirurgiska området Beredning: 1. Instrument Förberedelser. Alla kirurgiska ingrepp utförs med aseptisk teknik. En kirurgisk blå pad och sterila området dressing används. Allt material och alla instrument är steriliserade före användning. 6-0 suturer och bomull applikatorer spets, gasbinda, hane-hane 3-vägs kranar, och instrument autoklav steriliserade. Givare, PE-50 och PE-10 slang är Etenoxid steriliseras. Alla 3-vägs kranar, sprutor och kanyler tas emot sterila. 6-0 Suture är skuren i 1-tums bitar (6 st / djur) och läggs i små sterilisering påsar. Bomull-tip applikatorer, 4×4 rutor gasbinda och hane-hane 3-vägs kranar sätts i antingen små eller medelstora sterilisering påsar och autoklaveras. Vår kirurgiska instrument är autoklaven steriliseras varje kväll. De tvättas efter en operation med antibakteriell tvål och kranvatten. De får torka på en ren kirurgisk blå pad. De är sedan försiktigt placeras i en sterilisering påse och steriliseras för att användas nästa dag. Eftersom givare och slangar har plastkomponenter, måste de steriliseras med gas, det vill säga etylenoxid. PE-10 slangar skärs i 5-cm bitar och placeras i en liten sterilisering påse. PE-50 slangar skärs i 18-tums bitar och placeras i ett medium sterilisering påse. 2. Kirurgiska området. För att ställa upp de kirurgiska området, först, slå på den heta pärlan autoklav så att den når rätt temperatur 300-350 ° C innan operationer. Sedan fortsätta till nästa steg genom att placera kirurgisk blå kuddar ner på en alkohol torkas bänk. En platta går under mikroskop och den andra går på cirkulerande värmedyna där BP analysatorer finns. Placera ett sterilt område dressingen över både kirurgiska blå kuddar. Fyll en rostfri bricka stål instrument 1 / 3 av vägen med 70% alkohol. Använd nog 70% EtOH för att täcka alla kirurgiska instrument. Använd en separat steril fält dressing och placera den bredvid mikroskopet. Placera alla sterila instrument, suturer, gasbinda, och katetrar på detta sterila fältet. Var försiktig när du öppnar sterila instrument och sutur inte kontaminera dem genom att röra vid dem. Det är bäst att använda sterila handskar när du gör denna inställning förfarande. 2. Mekanisk Inställning och procedurer: 1. Kateter Set-up. För att ställa upp höger ben mus kateter används för att mäta BP, först ta på sterila handskar. Sedan få den sterila PE-10 slang från autoklaveras påsen. Ta tag i mitten av slangen med pekfinger och tumme vilket innebär att ungefär en tum mellan dem. Stretch den här delen av slangen bara lite att göra den tunnare i diameter att hjälpa till med katetrar. Efter stretching slangen skär den i två halvor med steril sax. Det 5-tums slangar bör nu två bitar ca 2 ½ inches i längd. Se till att fasa utsträckt slutet. * Äger vinkel som inte det avfasade kanter för mycket då detta kan öka chanserna för spännande lumen genom att peta igenom undersidan av kärlväggen. Sätt i en 30G nål i den trubbiga töjning slutet av slangen. Skaffa en steril 1 ml spruta och en 3-vägs kranen. Använd en spritkompress att sterilisera toppen av 10cc sterila flaskan med hepariniserat saltlösning (0,1 ml Heparin/9.9ml Saline). Fyll sprutan med 0,6-0.7cc av heparin lösningen. Fäst 30G nål och kateter till slutet av 3-sätt som är direkt över från den manliga slutet. Fyll kranen, 30G nål, och PE-10 slang med heparin lösningen. Se till att få alla luftbubblor ur systemet. Det mest effektiva sättet att ta bort alla luftbubblor är att använda gravitation. Rikta nålen mot marken samtidigt låta slangen hänga på bänk. Ge nålen navet en knäpp på fingrarna och bubblorna flyter till toppen av heparin lösningen. Ta bort 30G nålen från 3-vägs och ta bort bubblor. Dra vätska i 3-vägs tillbaka in i 1 ml sprutan för att avlägsna eventuella bubblor som fastnar i 3-vägs och sätt tillbaka slangen till 3-vägs. Ungefär 1 ml av blandningen bör finnas kvar i sprutan. Musen får om 0.05cc av denna blandning (som ett resultat av rodnad katetern att upprätthålla patency vid isättning) motsvarande ca 1U heparin / mus. Placera det ifyllda kateter in det sterila området förband med kirurgiska instrument. För att ställa upp vänster ben murina kateter följa samma procedur som beskrivits ovan med undantag för 3-vägs kranen. Vänster ben används för att dra blod och 3-vägs kran är inte nödvändig. Fyll en annan steril 1 ml spruta med 0,15-0.2cc av hepariniserad koksaltlösning blandningen. Haka upp 30G nål och PE-10 Tubing direkt till 1 ml sprutan. Fyll Detta lämnade systemet ben kateter med lösningen. Ta bort bubblorna från detta system också. Placera den färdiga katetern på det sterila området förband med sterila instrument. 2. Givare Set-up. Anslut en steril givaren till digi-med BPA 400 analysator enligt mikro-med specifikationer. Bifoga en 3-vägs kran att båda ändarna av givaren. Fyll en 10cc spruta med Ringer-laktat lösning (LR) och bifoga den till 3-vägs så att givaren kommer att ligga platt på bänk. Sätt i en 23G nål i båda ändarna av bit av färdigskurna presterilized 18-inches PE-50 slangar. Fäst ena änden av PE-50 slangen till 3-vägs med 10cc spruta bifogas. Fyll 3-vägs och PE-50 set-up med LR. Se till att få all luft bubblorna ur systemet som beskrivs i föregående avsnitt. Sätt tillbaka 3-vägs till givaren och fyll givaren och 2: a 3-vägs med LR. Slutligen, fäst metall hane-hane Leur-lås kranen till 23G nålen för PE-50 slang för montering på höger ben murina kateter. * Det är viktigt att vätska kvar i givaren under drift. * Följ kalibrering och noll förfaranden i enlighet med Micro-med protokollet. 3. Kirurgiska och experimentell Förfarande: 1. Kirurgiska ingrepp. Börja med att administrera en intraperitoneal injektion av Pentobarbitol Natrium (Nembutol) (70mg/kg @ 1:10 utspädning). Detta förfarande sker genom dels plocka musen upp från sin bur med basen (mest proximala änden) av sin svans. Placera djuret på toppen av buren, medan du fortfarande håller sin svans. Ta tag i nacken nackskinnet av musen med tummen och långfingret på var sin sida av musen precis bakom framtassarna. Pekfingret används för att dra i huden på huvud / halsregionen tillbaka mot nackskinnet att immobilisera huvudet. Musens svans är sedan lindade och hålls mellan lillfingret och ringfingret medan ringfingret trycks in i ländryggen av musen ryggrad. Musen ska sova inom 5 minuter. Efter att djuret bedövas placera dem på metallen kirurgiska plattan i ryggläge. Den lösa slingan tejp teknik används för att immobilisera djuren genom att tejpa sina extremiteter. Den lösa slingan Tekniken innebär helt enkelt att skära tunna remsor av tejp och inslagning bandet löst runt varje förgrunden lemmar underlägsen den tassen och runt varje bakbenen underlägsen den tassen. Bandet är sedan fastnat tillbaka till sig själv och vänster över tejpen sitter i styrelsen. Detta gör att armar och ben av möss att anta en mer naturlig anatomiska läge. Djurets buk-och ljumsk-områden är sedan rakade med Oster A5 Clippers storlek 40 blad. En 4×4 gasväv är doused med Betadine och operationsområdet är sedan torkas för sterilitet. Efter immobilisering och sterilisering, är en noskon med 1 ml av isofluran placeras över musens nos i några sekunder innan det första snittet. Den noskon består av en 50cc koniskt rör fyllt med gasbinda. Hälften av botten av röret skärs ut att skapa ett utrymme för musen näsa för att vila inne utan kontakt. Ett lock (botten av en vävnad förvaringsbehållare) placeras på slutet av 50cc koniska för att säkerställa att isofluran ångor inte fly. När djurets andetag börjar långsamt, är en liten 4-5mm snitt i huden parallellt med vänster interna sneda muskler i buken och vänster tvärgående abdominus muskler. Dissekering av femoral ven och artär följer. Se till att inte skada omgivande muskler eller nerver touch. Till att börja denna dissektion, separera fettvävnad från sneda och tvärgående magmusklerna genom att ta tag i fettväven med dumonts på buken anslutningen. Dra denna vävnad bort från muskeln väggen. Sedan trubbigt dissekera längs magmusklerna retas bort fascia och fettvävnad använda den andra par dumonts. Bara under den här fettvävnaden ligger femoral ven och artär tillsammans med femoralisblockad. * Var noga med att inte skada vastus intermedius, medialis och lateralis muskeln i quadriceps femoris eller femoris rectus. Det finns egentligen ingen anledning att ta, eller ens röra dessa muskler. * RÖR INTE femoralisblockad Dissekera bort nerven genom att ta tag i fettvävnad som ligger bredvid. Dra denna vävnad i sidled från ven och artär och nerv kommer att följa som det är inbäddad i denna vävnad. Eftersom nerven dras i sidled, trubbigt dissekera fascian genom att placera andra dumonts, peka nedåt, mot artären samt öppna och stänga dem. Fartygen är mycket ytlig så se till att integräva i den underliggande muskler. När nerven är åtskilda, använd dumonts att separera fascian hålla fartygen till musklerna. Håll dumonts stängd och sätt de dumonts rygg till fartyg. Som toppen av dumonts visas på andra sidan av ven, öppna dem för trubbigt dissekera fascia. Håll dumonts rygg på fartyget och ta den första sutur. Sätt sutur i dumonts och dra sutur tillbaka genom öppningen mellan fartygen och den underliggande muskler. Återigen finns det ingen anledning att skada någon omgivande muskler. Sätt ett sammanlagt 3, 6-0 suturer runt ven och artär. Sutur 1 är den mest proximalt om magmusklerna. Knyt en knut, men lämna den lös och hemostat det. Den konkava kanten av hemostat bör vila på djurets bukhåla. Sutur 2 är den mest distala på plats. Detta sutur kan knytas omedelbart underbindning av fartyg och hemostated, återigen konkav nedåt. Den distala och proximala suturer används för att dra fartyg spänd (för att förhindra blodförlust) och lyfta dem lite till stöd i katetrar. Suture 3 är en kateter stöd sutur. Placera sutur mellan distala och proximala suturer. Knyt en lös knut som kommer att användas för att säkra katetern inne i fartyget efter insättningen. När suturerna är säkra, identifiera pulsådern genom den tjocka kärlväggen. Det är mycket vitt. Gör ett litet snitt på toppen av artären med microscissors. Gör detta hål nära distala suturen så det finns en riklig mängd artär för den första katetrar. Använd dumonts att öppna hålet genom att placera ena änden av dumonts i den arteriella kärl lumen och stänga dem över kärlväggen. Var noga med mitten suturen är proximalt om arteriell hålet så att den kan användas för att hålla katetern på plats efter första insättningen. Håll kärlväggen tryck kateter in i lumen samtidigt dra fartyget över katetern. Lätt binda mitt stöd suturen för att hålla katetern på plats. Släpp proximala hemostat. Denna release kommer att lossa proximala sutur och öppna sutur runt fartygen. Vid det här laget bör det arteriella trycket pressa blodet tillbaka i katetern. Pulserande blod ska visas i katetern. Håll fartyg runt katetern med en Dumont och använda de övriga att pressa kateter i kärlet ca 4-5mm. Hålla fartyget runt katetern hjälper till att förhindra att riva av artären. Spetsen på katetern bör vila precis under den interna sneda och tvärgående abdominus muskler. För blodpropp förebyggande i de arteriella linjen, dra tillbaka blod i katetern och tryck tillbaka den i musen flera gånger för att ingjuta hepariniserat vätska. Upprepa proceduren för det andra benet för bilaterala lårbensartären kanylering. Haka djuret upp till den fysiologiska parametern bildskärmen, dvs BPA-400 analysator och spola arteriella linjer. Ställ 1 eller 2 droppar steril koksaltlösning i den kirurgiska öppningen för att hålla den omgivande vävnaden fuktig. Se till att hålla detta område mättade under hela förfarandet. Placera ett sterilt område dressingen över djuret under hela förfarandet för att bibehålla sterilitet. Placera kirurgiska instrument till 70% alkohol och torka dem med steril gasbinda. Lägg dem i den varma pärla autoklav för ~ 20 sekunder för sterilisering mellan djur. Ta bort kirurgiska instrument och spraya dem med 70% alkohol för att hjälpa dem svalna. Placera dem på steril kompress. Se till att det inte finns någon alkohol kvar på instrument som kommer droppa tillbaka in i nästa djur. 2. Hemorragisk Shock. Över en 15min. tidsram, är ca 1 / 2 av musens blodvolym tillbaka uppnå ett genomsnittligt blodtryck på 28-32mm Hg. * För en 25-27g mus den ursprungliga volymen av blod ut för att uppnå önskat tryck är cirka 0.6cc Detta förfarande är ett fast tryck metod i motsats till en fast volym. Dessa förfaranden kan vara dock följas för både fast tryck och fast volym blödning. Samtidigt som konsekvent övervakas, kommer djuret kvar i hemorragisk chock för 1,5-3 timmarna. Eftersom djuret försöker kompensera och medelartärtryck börjar stiga igen något (synlig via BP / HR analysator) återkalla mer blod för att uppnå önskat tryck. Även kosttillskott (0.05cc Nembutol IP) är sällan någonsin behövt under HS förfarandet kommer djurens andning, morrhår rörelse, reflex tester, och den digitala BP / HR läsa att avgöra när ett djur behöver ett tillägg av anestesi. Djuren hålls under lampan och på ett cirkulerande värmedyna för att upprätthålla en temperatur på 36-37 ° C genom Hemorragisk Shock förfarande. Temperaturen kontrolleras via en rektalsond. 3. Återupplivning. Efter chocken tid elapsES, är djuret återupplivat (R) med hjälp av laktat Ringers (LR) lösning till en fast volym på 3x varje djurs utgjuta blod volym. LR volym administreras via en sprutpump som att dosera, med en konstant hastighet, volym över en 15min. intervall. Ta bort katetern och ligate de fartyg som använder 3 suturer. Dra kateter precis förbi proximala suturen och knyta denna sutur helt av. Det kommer att förhindra blodförlust. Säkerheter flöde förhindrar bakbenen blir ischemisk. 4. Inlägg Rescitation. Efter R båda bakbenen öppningar sys upp med sterila 4-0 PDSII sutur. Den lösa slingan tejpen tas bort och att djuren placeras i en ren bur, som hålls på en cirkulerande värmedyna under flera timmar efter tillfrisknandet. Smärtstillande måste administreras som djuren börjar vakna ur narkosen att korrekt hantera smärta. Buprenorfin (0.1mg/kg) injiceras subkutant som djuren börjar fysisk aktivitet, men inte innan, för att inte äventyra lungfunktion. Användning av aggressiv postoperativ övervakning som motiveras av IACUC godkänt protokoll, individuella beteenden djur, och nuvarande medicinska tillstånd rekommenderas. 4. Hemligheter för framgång: När dissekera kärlen, se till att inte röra femoralisblockad Var noga med att inte skada rectus femoris, rectus lateralis och vastus medialis muskler. Det finns egentligen ingen anledning att ta, eller ens röra dessa muskler. Gör inte vinkeln på avfasning av katetern alltför skarp som detta kommer att leda till att katetern ut ur lumen och okontrollerad blödning Se till att ta det extra besväret att förbli så sterilt som möjligt. Se till att det finns några luftbubblor i någon av katetern eller givaren system. Se till att ha LR vätska i givaren när den är i drift. En torr köra kan skada ditt BP-system. Gör arteriella hålet liten. Gör arteriell hålet nära den distala sutur. Tryck katetern samtidigt som du drar fartyg över det för katetrar för att undvika rippning artären. Var noga med att hålla den kirurgiska öppningar i benen mättad med steril koksaltlösning för att förhindra okontrollerade vävnadsskada eller vätskeförlust. Tålamod och finess är kritiska. Var uppmärksam på djurets fysiologi under hela försöksperioden. 5. Postoperativa Oro: Kontrollera om ischemi i benet. Även säkerheter flöde bör förhindra detta. Djuret kan ha problem med att använda bakbenen som en följd av kirurgisk manipulation och tillhörande inflammation. Hantera smärta på lämpligt sätt. Röra och därefter skadar nerven kan leda till oförmåga djuret att mobilisera.