Denna video kommer att demonstrera metoder för att transurethrally framkalla mus urinvägsinfektioner och kvantifiera omfattningen av resulterande infektioner.
Uropathogenic bakteriestammar av intresse odlas på agar. Generellt uropathogenic<em> E. coli</em> (UPEC) och andra stammar kan odlas över natten på Luria-Bertani (LB) agar vid 37 ° C i luften. UPEC stammar växa som gulvita genomskinliga kolonier på LB agar. Efter bekräftelse av lämpliga koloni morfologi, är ensamstående kolonier sedan plockas som odlas i buljong. LB buljong kan användas till de flesta uropathogenic bakteriestammar. Två seriella, övernattning LB buljong kulturer kan användas för att öka uttrycket av typ I pili, en väldefinierad virulensfaktorn för uropathogenic bakterier. Buljong kulturer spädas till önskad koncentration i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Åtta till tolv veckor gamla honmöss placeras under isoflurananestesi och transurethrally ympas med bakterier med hjälp av polyeten slang-täckt 30 gauge sprutor. Typiska inokulat, som måste vara empiriskt bestämmas för varje bakterie / musstam kombination, är 10<sup> 6</sup> Till 10<sup> 8</sup> Cfu per mus i 10 till 50 mikroliter PBS. Efter att önskad infektionen period (en dag till flera veckor), urinprov och urinblåsan och båda njurarna skördas. Varje organ är malet, placeras i PBS, och homogeniserade i en blå Bullet homogeniseringsapparat. Urin och vävnad homogenat är seriellt spätts i PBS och odlade på lämpliga agar. Följande dag, kolonibildande enheter räknas.
Induktion av musen urinvägsinfektion genom transuretral inokulering av bakterier är en sedan länge etablerad, men tekniskt krävande förfarande 11. Hung och Hultgren publicerade nyligen en utmärkt genomgång av transuretral teknik för musen urinvägsinfektion 13. I denna skrift försöker vi att ytterligare belysa de finare detaljerna i denna experimentella strategi.
Nybörjare kan öva sin teknik genom att utföra ett mittlinjen laparotomi att exponera urinblåsa…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka för Shelly Xie och Jennifer Payne för teknisk experthjälp. Detta arbete har gjorts möjlig genom bidrag från Society of Pediatric Urology och Stanford Pediatric Research Fund.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) | E&K Scientific | 640201 | ||
Caps for cryovial tubes, with ‘O’ ring | E&K Scientific | 440011-N | ||
Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | ||
Zirconium Oxide Beads (0.5mm) | Next Advance | ZROB05 | ||
Stainless Steel Beads (1.6mm) | Next Advance | SSB16 | ||
Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) | Next Advance | SSB14B | ||
CBA/J Mice, 8-12 week old female | Jackson Laboratories | 000656 | ||
Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) | EMD | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | ||
LB agar | ||||
LB broth | EMD | 1.10285.0500 | ||
Isoflurane (Aerrane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | ||
Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-601 | ||
Eosin-methylene blue (EMB) agar powder | Himedia Laboratories | MM022-500G | ||
MacConkey agar powder | Difco | 212123 | ||
LB agar powder | Difco | 244520 | ||
Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] | BD Biosciences | 427401 | ||
30 gauge needles, 1/2 inch | BD Biosciences | 305106 | ||
1 ml tuberculin Slip-Tip syringe | BD Biosciences | 309602 | ||
3 ml Luer-Lock syringe | BD Biosciences | 309585 |