RhoC GTPase सक्रियकरण परख
Summary
इस प्रोटोकॉल परख नीचे एक पुल का इस्तेमाल करने के लिए कोशिकाओं के भीतर सक्रिय RhoC GTPase के स्तर का निर्धारण.
Abstract
RhoC GTPase RhoA GTPase 91% अनुरूपता है. कोशिकाओं में इसकी व्यापकता के कारण, कई RhoA GTPase के लिए अभिकर्मकों और तकनीक को विकसित किया गया है. हालांकि, RhoC GTPase अपेक्षाकृत कम स्तर पर metastatic कैंसर की कोशिकाओं में व्यक्त किया है. इसलिए, कुछ RhoC विशेष अभिकर्मकों विकसित किया गया है. हम एक रो सक्रियण परख RhoC GTPase का पता लगाने के अनुकूल है. इस तकनीक को जीएसटी – रो बाध्यकारी डोमेन संलयन सक्रिय RhoC GTPase खींच प्रोटीन का इस्तेमाल करता. इसके अलावा, हम परख की शुरुआत में कुल प्रोटीन फसल के कुल का स्तर (जीटीपी और सकल घरेलू उत्पाद (जीडीपी) बाउंड) RhoC GTPase निर्धारित कर सकते हैं. यह सेल में सक्रिय बनाम कुल RhoC GTPase के निर्धारण के लिए अनुमति देता है. लेकिन इस प्रक्रिया के कई व्यावसायिक संस्करण विकसित किया गया है, वाणिज्यिक किट RhoA GTPase के लिए अनुकूलित कर रहे हैं और आमतौर पर अच्छी तरह से RhoC GTPase के लिए काम नहीं करते. परख की भाग RhoC विशिष्ट एंटीबॉडी के विकास के रूप में किया गया है के रूप में अच्छी तरह से संशोधित.
Protocol
Discussion
प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण कदम ताजा जीएसटी – आरबीडी की पीढ़ी है. इस कदम के करीब ध्यान देना करने में विफलता विफलता के लिए मुख्य कारण है. जीएसटी आरबीडी (1.2) की पीढ़ी से सेल lysate (2.5) के साथ रात भर ऊष्मायन सभी चर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
रक्षा विभाग W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 और W81XWH-08-1-0356
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gluthione-sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | ||
| Criterion 4-20% Tris-HCl gels | BioRad | 345-0032 |
References
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells. Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).
- Golen, K. L. v. a. n. Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor. Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).
- Golen, K. L. v. a. n. Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer. Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).
- Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility. Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).
- Hall, C. L. Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase. Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).
- Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis. Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).
- van Golen, K. L. CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac. J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. . Int J Cancer. , (2010).
- Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior. J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).
