RhoC GTPase Aktivering analys
Summary
Detta protokoll använder sig av en pull down analys för att bestämma nivåerna av aktiva RhoC GTPase i celler.
Abstract
RhoC GTPase har 91% homologi till RhoA GTPase. På grund av dess förekomst i celler, har många reagenser och tekniker för RhoA GTPase utvecklats. Det är dock RhoC GTPase uttrycks i metastaserande cancer celler på relativt låga nivåer. Därför har få RhoC-specifika reagenser utvecklats. Vi har anpassat en Rho aktivering test för att upptäcka RhoC GTPase. Denna teknik utnyttjar en GST-Rho bindande protein domän fusion att dra ut aktiva RhoC GTPase. Dessutom kan vi skörda totalprotein i början av analysen för att bestämma nivåerna av total (GTP och BNP bundna) RhoC GTPase. Detta möjliggör för bestämning av aktivt kontra totala RhoC GTPase i cellen. Flera kommersiella versioner av detta förfarande har utvecklats är dock den kommersiella kit optimerad för RhoA GTPase och normalt inte fungerar bra för RhoC GTPase. Delar av analysen har modifierats, liksom utveckling av en RhoC-specifik antikropp.
Protocol
Discussion
Det mest kritiska steget i förfarandet är den generation av färska GST-RBD. Underlåtenhet att ägna stor uppmärksamhet åt detta steg är främsta orsaken till misslyckande. Alla steg, från generation av GST-RBD (1,2) till natten inkubation med cellen lysat (2,5), bör göras i en enda dag. En annan avgörande steg är att se till att det finns tillräckligt med celler att producera cellen lysates. Detta är särskilt viktigt när man tittar på RhoC GTPase, som tenderar att vara närvarande i låga halter i celle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Institutionen för Defense W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 och W81XWH-08-1-0356
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gluthione-sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | ||
| Criterion 4-20% Tris-HCl gels | BioRad | 345-0032 |
References
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells. Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).
- Golen, K. L. v. a. n. Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor. Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).
- Golen, K. L. v. a. n. Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer. Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).
- Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility. Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).
- Hall, C. L. Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase. Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).
- Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis. Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).
- van Golen, K. L. CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac. J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. . Int J Cancer. , (2010).
- Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior. J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).
