Het bestuderen van de effecten van Matrix stijfheid op de cellulaire functie gebruik Acrylamide-based Hydrogelen
Summary
Het effect van substrata stijfheid op cellulaire functie kan worden gemodelleerd<em> In vitro</em> Gebruik van polyacrylamide hydrogelen van verschillende naleving.
Abstract
Weefsel stijfheid is een belangrijke determinant van cellulaire functie, en veranderingen in weefsel stijfheid worden vaak geassocieerd met fibrose, kanker en hart-en vaatziekten 1-11. Traditionele cel biologische benaderingen aan het bestuderen van cellulaire functie door culturen van cellen op een vaste ondergrond (plastic borden of glas dekglaasjes) die niet kan goed zijn voor het effect van een elastische ECM of de variaties in ECM stijfheid tussen de weefsels. Om het model in vivo weefsel compliance in vitro, wij en anderen gebruiken ECM-gecoate hydrogels. In ons laboratorium worden de hydrogelen op basis van polyacrylamide die het bereik van het weefsel naleving biologisch 12 gezien kan nabootsen. "Reactieve" dekglaasjes worden gegenereerd door incubatie met NaOH gevolgd door toevoeging van 3-APTMS. Glutaraldehyde wordt gebruikt om cross-link van de 3-APTMS en de polyacrylamide gel. Een oplossing van acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) en ammoniumpersulfaat wordt gebruikt voor de polymerisatie van de hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is opgenomen in de AC-oplossing voor het verknopen ECM eiwit aan de hydrogel. Na polymerisatie van de hydrogel, is de gel oppervlak bedekt met een ECM-eiwit van de keuze, zoals fibronectine, vitronectine, collageen, etc.
De stijfheid van een hydrogel kan worden bepaald door reologie of atomic force microscopie (AFM) en aangepast door het variëren van het percentage van de AC-en / of bis-AC in de oplossing 12. Op deze manier kan substraat stijfheid worden afgestemd op de stijfheid van de biologische weefsels, die ook kan worden gekwantificeerd aan de hand reologie of AFM. Cellen kunnen vervolgens worden ingedeeld op deze hydrogelen en gekweekt op basis van de vereiste experimentele omstandigheden. Beeldvorming van de cellen en hun herstel voor moleculaire analyse is eenvoudig. Voor dit artikel, definiëren we zachte ondergrond als die met elastische moduli (E) <3000 Pascal en stijve ondergrond / weefsels als die met E> 20.000 Pascal.
Protocol
Discussion
Een cruciaal element van de hydrogel polymerisatieproces is om te voorkomen dat luchtbel ontstaan waardoor cellen te binden aan de glazen dekglaasje in plaats van de ECM-gecoate hydrogel zelf. Dit kan voorkomen worden door zorgvuldig te pipetteren de polymerisatie oplossing na vortexen en visueel ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen verstrikt zijn geraakt in de gel. We raden altijd aan de voorbereiding van extra "reactieve" coverslips en hydrogels om te zorgen genoeg voor experimenten.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Werk is ons laboratorium wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glutaraldehyde, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Store at -20°C | |
| 3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store at room temperature | |
| SurfaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific | 42800 | Store at room temperature | |
| NHS (N-hydroxysucinimide Ester) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Store at 4°C Replace monthly | |
| Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Store at 4°C | |
| Coverslips (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | ||
| Coverslips (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
References
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism. J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).
- Boonyasirinant, T. Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging. J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
- Lee, R. T. Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study. Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples. Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).
- Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control. Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).
- Klein, E. A. Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening. Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).
