होस्ट में शामिल कारक के लिए आरएनएआई स्क्रीनिंग चेचक वायरस संक्रमण का उपयोग ड्रोसोफिला कक्ष

Summary

उपन्यास मेजबान कारकों वायरल संक्रमण में शामिल सेल आधारित जीनोम चौड़ा समारोह आरएनएआई स्क्रीनिंग के नुकसान के माध्यम से पहचाना जा सकता है. एक<em> ड्रोसोफिला</em> सेल संस्कृति मॉडल विशेष रूप से इस दृष्टिकोण और आरएनएआई के आसानी और दक्षता के कारण करने के लिए उत्तरदायी है. यहाँ हम इस तकनीक का उपयोग का प्रदर्शन<em> चेचक</em> एक उदाहरण के रूप में वायरस.

Abstract

वायरल रोगज़नक़ों एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरा प्रतिनिधित्व करते हैं, न केवल वायरस मानव रोग के प्राकृतिक महामारी पैदा कर सकता है, लेकिन उनके bioterrorism में क्षमता का उपयोग भी एक चिंता का विषय है. सेलुलर कारकों की एक बेहतर समझ है कि प्रभाव संक्रमण बहुत जरूरी चिकित्सा विज्ञान के विकास की सुविधा होगी. शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) कई जीवों के पूरा जीनोम अनुक्रमण के साथ मिलकर प्रौद्योगिकी में हाल के अग्रिमों के जीनोम चौड़ा, सेल आधारित नुकसान के समारोह स्क्रीन के अनुकूलन के लिए नेतृत्व किया गया है ड्रोसोफिला कोशिकाओं विशेष रूप से जीनोम पैमाने पर की वजह से स्क्रीन करने के लिए उत्तरदायी हैं. आराम और इस प्रणाली में ^एक आरएनएआई दक्षता. महत्वपूर्ण बात है, वायरस की एक विस्तृत विविधता चिकित्सा और कृषि ^2,3,4 महत्व के स्तनधारी वायरस के एक नंबर सहित ड्रोसोफिला कोशिकाओं, संक्रमित कर सकते हैं. ड्रोसोफिला में पिछला आरएनएआई स्क्रीन मेजबान कारकों है कि प्रविष्टि, अनुवाद और ^{आरएनए} 5 प्रतिकृति सहित वायरस के संक्रमण में विभिन्न चरणों के लिए आवश्यक हैं की पहचान की है . इसके अलावा, सेलुलर ड्रोसोफिला सेल संस्कृति में वायरल प्रतिकृति के लिए आवश्यक कारकों में से कई भी मानव इन ^{वायरस 4,6,7,8,} 9 के साथ संक्रमित कोशिकाओं में सीमित कर रहे हैं. इसलिए, मेजबान कारकों वायरल संक्रमण के दौरान सहयोजित की पहचान antiviral चिकित्सा के लिए उपन्यास लक्ष्य प्रस्तुत करता है. यहाँ हम एक उच्च throughput आरएनएआई सेलुलर कारकों की पहचान वायरल संक्रमण में शामिल हैं, एक उदाहरण के रूप में चेचक वायरस का उपयोग कर स्क्रीन के लिए एक सामान्यीकृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे.

Protocol

भाग 1: आरएनएआई 384 खैर प्लेट्स में स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों का मानकीकरण आवश्यक है. हम है Schneider मीडिया के अलग – अलग बहुत, भ्रूण गोजातीय सीरम, और धुंधला अभिकर्मकों परीक्षण. फिर हम विभाज्य और पूरे स्क्रीन के लिए एक ही बहुत का उपयोग करें. किसी भी परख के लिए, यह सबसे अच्छा है के लिए कई अलग अलग सेल लाइनों के लिए निर्धारित है जो सबसे करने के लिए अपने जैविक पढ़ने के बाहर करने के लिए उत्तरदायी है परीक्षण. हम आम तौर पर S2-DRSC लाइन का उपयोग करें. 25 में डिग्री पूरा है Schneider मीडिया में सी ड्रोसोफिला कोशिकाओं के विकास. है Schneider मीडिया 10% गर्मी निष्क्रिय FBS एल glutamine 1X 1X / पेन strep एंटीबायोटिक दवाओं ड्रोसोफिला कोशिकाओं अर्द्ध पक्षपाती हैं और trypsinization बिना हर चार दिनों passaged बोतल बंद कोशिकाओं pipetting और एक ताजा फ्लास्क में 1:10 कोशिकाओं गिराए. कक्ष प्रयोगों के लिए लॉग चरण में होना चाहिए. प्लेट, थाली और दिन के लिए दिन परिवर्तनशीलता बहु अच्छी तरह प्लेटें सभी तरल परिवर्धन के लिए स्वचालित तरल से निपटने के उपयोग के माध्यम से कम से कम कर रहे हैं. हम एक WellMate (मैट्रिक्स) का उपयोग करें. WellMate टयूबिंग तैयार. स्प्रे और 70% इथेनॉल के साथ हुड WellMate. पैकेजिंग और 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे से टयूबिंग निकालें. WellMate पर वितरण की स्थिति में टयूबिंग कैसेट डालें. 70% इथेनॉल के 25 एमएल के साथ प्रधानमंत्री टयूबिंग. 15 मिनट, फिर इथेनॉल का एक और 25 एमएल के साथ प्रधानमंत्री के लिए इथेनॉल में टयूबिंग जीवाणुरहित. भड़काना द्वारा बाँझ पीबीएस के 50 एमएल के साथ टयूबिंग कुल्ला. फ्लास्क और गिनती से कोशिकाओं को हटाना. गोली कोशिकाओं को इतना है कि आप 25% से अधिक की जरूरत (300xg, 5 मिनट) है. अच्छी तरह से प्रति वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या परख लंबाई के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए. जब स्वचालित छवि विश्लेषण का आयोजन, कोई सेल clumping के साथ एक एकल monolayer छवि विभाजन के लिए आदर्श है. सीरम मुक्त है Schneider मीडिया में 1.7×10 6 कोशिकाओं / एमएल pelleted कोशिकाओं Resuspend. हम 384 अच्छी तरह से पूर्व 250ng/well की एकाग्रता में एक dsRNA का व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुस्तकालय के साथ aliquoted प्लेटों में स्क्रीन प्रदर्शन करते हैं. प्रत्येक थाली के कई कुओं नियंत्रण के लिए खाली छोड़ दिया जाता है, जो मैन्युअल रूप से जोड़ रहे हैं. हम एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में luciferase dsRNA उपयोग. हम थ्रेड (dIAP) के खिलाफ मजबूत आरएनएआई के लिए एक नियंत्रण के रूप में dsRNA उपयोग. इस नाटकीय कोशिका मृत्यु में विरोधी apoptotic कारक परिणामों के नीचे दस्तक और एक त्वरित दृश्य नीचे दस्तक की गुणवत्ता का आकलन है. अन्त में, हम वायरल रिपोर्टर के खिलाफ एक dsRNA उपयोग करते हैं, इस मामले में बीटा galacosidase में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में करने के लिए मान्य है कि हम हमारे परख का उपयोग कर पढ़ने के लिए बाहर वायरल संक्रमण को बाधित कर सकते हैं. यदि थाली में सेल बोने, विभाज्य 1 आसान दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए अच्छी तरह के कोने में μl dsRNA के समय पर dsRNA खोलना है, तो अच्छी तरह से नीचे (300xg, 1 मिनट) पर कोशिकाओं को जोड़ने से पहले dsRNA अपकेंद्रित्र. 10 μL प्रत्येक अच्छी तरह से ऊपर तैयार कोशिकाओं को जोड़ने के लिए WellMate का उपयोग करें. 300xg, 1 मिनट centrifuging प्लेटों पर कोशिकाओं स्पिन. 45 मिनट के लिए 25 ° सी इनक्यूबेटर में सेते हैं. 20 μL पूरा श्नाइडर मीडिया जोड़ें और 300xg, 1 मिनट अपकेंद्रित्र. Humidified Tupperware कंटेनर में रखें प्लेटों पानी लथपथ कागज तौलिये के साथ खड़े हैं. की मात्रा 384 एक अच्छी तरह से छोटा है, इस प्रकार, वाष्पीकरण जीव विज्ञान, जो बारी में बढ़त कुओं के पढ़ने के बहिष्कार में artifactual परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं पर बड़ा प्रभाव हो सकता है. इस पर काबू पाने के लिए, प्लेटें उच्च आर्द्रता के तहत रखा जाना चाहिए. तीन दिनों के लिए सेते मजबूत पछाड़ना के लिए अनुमति देने के लिए. वहाँ कोई मीडिया को बदलने के लिए या इस समय के दौरान humidified कंटेनर खोलने की जरूरत है. भाग 2: चेचक वायरस के साथ संक्रमण जीवाणुरहित 15 मिनट के लिए Quatricide में बहु चैनल Aspirator, तो 70% इथेनॉल में कुल्ला. WellMate रूप में ऊपर वर्णित तैयार. सीरम मुक्त मीडिया में पूरा मीडिया 01:05 गिराए द्वारा संक्रमण के लिए 2% FBS के साथ Schneider मीडिया की तैयारी. 0.8 उम सेलुलर मलबे को हटाने के लिए या शुद्ध वायरस का उपयोग फिल्टर सिरिंज के माध्यम से फ़िल्टर कच्चे वायरस शेयर. पतला 2% सीरम है Schneider मीडिया में चेचक वायरस 2 के संक्रमण की बहुलता (MOI) प्राप्त करने के लिए. WellMate टयूबिंग से पीबीएस निकालें, और पतला वायरस के साथ प्रधानमंत्री तक टयूबिंग हवाई बुलबुले से मुक्त है. निष्फल मल्टी चैनल Aspirator और वैक्यूम कई गुना का प्रयोग करने के लिए धीरे dsRNA इलाज ड्रोसोफिला कोशिकाओं की प्लेटों से मीडिया को दूर करने के लिए. WellMate का उपयोग प्लेटों पर अच्छी तरह से प्रति 30 μL वायरस बग़ैर. प्लेटें 300xg पर 1 मिनट अपकेंद्रित्र. WellMate टयूबिंग जीवाणुरहित. 10% blea के 25 एमएल के साथ प्रधानमंत्रीCh, 10 मिनट प्रतीक्षा करें, और एक और 25 एमएल 10% ब्लीच के साथ प्रधानमंत्री. 50 एमएल पानी के साथ प्रधानमंत्री टयूबिंग 50 एमएल 70% इथेनॉल के द्वारा पीछा किया. इसकी पैकेजिंग के लिए टयूबिंग लौटें. Humidified Tupperware कंटेनर के लिए प्लेटें लौटें. 48 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. भाग 3: धुंधला प्लेट्स 15 μL 4% / 10 मिनट के लिए formaldehyde के पीबीएस में प्लेटों को ठीक करें. लिक्विड एक Aspirator मल्टी चैनल और हर कदम पर वैक्यूम कई गुना का उपयोग करने के लिए निकाल दिया जाता है. एक बार प्लेटें, बाँझ उपकरणों तय है और अभिकर्मकों नहीं रह रहे हैं आवश्यक है. ठीक निकालें और WellMate का उपयोग करने के लिए 30 μL PBST (पीबीएस 0.1% Triton एक्स) जोड़ने. 10 मिनट और दोहराने सेते हैं. प्रचालन WellMate रूप में ऊपर वर्णित है, सिवाय ट्यूबिंग निष्फल हो की जरूरत नहीं है. चेचक संक्रमण का पता लगाने के लिए हम एक β-galactosidase / जल्दी और देर चेचक प्रमोटर द्वारा संचालित संवाददाता का उपयोग करें. 10 मिनट के लिए ब्लॉक में तरल और सेते कोशिकाओं (2% BSA साथ PBST) निकालें. ब्लॉक में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला, तरल पदार्थ को हटा दें और अच्छी तरह से एक बहु चैनल का उपयोग कर प्रत्येक दोहराने pipettor (मैट्रिक्स) से 15 μL एंटीबॉडी जोड़ने. नीचे प्लेट (300xg, 1 मिनट) स्पिन के लिए, एक स्पष्ट स्टीकर के साथ कवर, और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर सेते. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें, और WellMate उपयोग PBST 3 बार, 10 मिनट प्रत्येक में कुओं को धोने. Fluorescently लेबल माध्यमिक FITC (एंटीबॉडी) और ब्लॉक में दाग परमाणु पतला है, और एक मल्टी चैनल दोहराने pipettor का उपयोग कुओं को 15 μL जोड़ने. सेते कमरे के तापमान पर 1 घंटे प्लेटें, प्रकाश से रक्षा की. PBST 3 बार, प्रत्येक 10 मिनट WellMate का उपयोग में कुओं को धो लें. स्पष्ट स्टीकर, कवर, और दुकान के साथ थाली 4 पर ° तीन सप्ताह के लिए सी सील. भाग 4: इमेजिंग और छवि विश्लेषण 20X आवर्धन छवि प्लेटें एक स्वचालित माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. कुल (DAPI) नाभिक और संक्रमित कोशिकाओं (FITC) की छवियों पर कब्जा. प्रत्येक चैनल के लिए जोखिम समय व्यक्तिगत ऑप्टिमाइज़ क्रम में गतिशील रेंज को अधिकतम. छवियों, स्थान के अलावा 1um, कि ऊपर और नीचे ध्यान केंद्रित करने की उम्मीद विमान विमानों अवधि के एक Z ढेर लेने के द्वारा स्वत: ध्यान समारोह ठीक धुन. एक बार इष्टतम फोकल हवाई जहाज़ में स्थित है, autofocus सेटिंग तदनुसार समायोजित. छवि पूरी थाली, दोनों Hoechst (DAPI) चैनल और वायरस चैनल (FITC) में अच्छी तरह से प्रति कम से कम तीन छवियों पर कब्जा. अच्छी तरह से एक के भीतर कई अलग अलग क्षेत्रों से साइटों चुनें क्रम में छवियों है कि एक पूरे के रूप में अच्छी तरह का प्रतिनिधित्व करते हैं पर कब्जा. MetaXpress सॉफ्टवेयर खंड के लिए एक पत्रिका छवि लिखने और गणना नाभिक मॉड्यूल का उपयोग करने के लिए परमाणु (कुल कोशिकाओं) एक थाली के लिए और संक्रमण (FITC) धुंधला के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना का उपयोग करें. प्रतिशत संक्रमण (100 * FITC सकारात्मक / कुल कोशिकाओं) की गणना और परिणत लॉग इन करें. उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए हम एक मजबूत Z प्रत्येक थाली के मंझला और अन्तःचतुर्थक श्रेणी के आधार पर स्कोर का उपयोग करें. इस विधि outliers और nonsymmetric डेटा के लिए असंवेदनशील है, और इस प्रकार भी कमजोर या उदारवादी 10 हिट की पहचान करने में अधिक से अधिक शक्ति प्रदान करता है है. प्रत्येक थाली के लिए, मंझला लॉग तब्दील डेटा से subtracted है. तो परिणामस्वरूप मान .74 बार अन्तःचतुर्थक श्रेणी (75 वें शतमक और 25 वें प्रतिशतक के मूल्यों के बीच अंतर) द्वारा विभाजित हैं. 0.74 कारक लगभग एक मानक सामान्य वितरण के लिए प्रयोग किया जाता है. मजबूत जेड स्कोर मानक विचलन में थाली की औसत से दूरी के एक उपाय है. उदाहरण के लिए, 2 के एक मजबूत Z स्कोर इंगित करता है अच्छी तरह के संक्रमण% ~ प्लेट मंझला या <0.05 पी से 2 मानक विचलन है. सेल नंबर का विश्लेषण करने के लिए साइटोटोक्सिक उम्मीदवारों की पहचान. परमाणु गिनती की मजबूत जेड स्कोर की गणना. उम्मीदवारों के साथ एक मजबूत Z <डुप्लिकेट स्क्रीन में -2 साइटोटोक्सिक माना जाता है. वेल्स कि cytotoxicity बिना 2> या <-2 डुप्लिकेट स्क्रीन (पी .०,०२५ <) के प्रतिशत के संक्रमण के लिए एक मजबूत स्कोर जेड प्राथमिक स्क्रीन से संभावित उम्मीदवारों पर विचार कर रहे हैं. सकारात्मक उम्मीदवारों स्वतंत्र अभिकर्मकों का उपयोग करने के लिए मान्य हैं. dsRNAs mRNA की एक और क्षेत्र से ब्याज की जीन के खिलाफ उत्पन्न कर रहे हैं और परीक्षण किया इसके बाद के संस्करण के रूप में. उन जीन है जो के लिए दो स्वतंत्र dsRNAs एक ही phenotype है आगे के अध्ययन के लिए विचार किया जा सकता है है. भाग 5: प्रतिनिधि छवियाँ और संक्रमण दर की व्याख्या चित्रा 1. Uninfected कुओं चेचक वायरस के प्रोटीन के लिए किसी भी धुंधला हो जाना नहीं दिखा, जबकि एक अच्छी तरह से संक्रमित प्रतिनिधि चेचक व्यक्त बीटा galactosidase (βgal), प्रोटीन के रूप में immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा के लिए धुंधला हो जाना सकारात्मक कोशिकाओं हैं.वायरस हरी = नाभिक = नीला. चित्रा 2. स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रत्येक उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित मापदंडों का उपयोग कर छवि में संक्रमण quantifies. छवि में एक प्रतिनिधि, सेल नाभिक और वायरल प्रतिजन व्यक्त कोशिकाओं की संख्या की कुल संख्या आकार और स्थानीय पृष्ठभूमि धुंधला ऊपर धुंधला की तीव्रता पर आधारित गिने जाते हैं. चित्रा 3. मुद्दा देखें (dIAP) के नॉकडाउन लक्ष्य जीन की मजबूत आरएनएआई रिक्तीकरण के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. विरोधी apoptotic इस पहलू की पछाड़ना नाटकीय कोशिका मृत्यु की ओर जाता है है. नाभिक = नीला. Luciferase चित्रा 4 नॉकडाउन संक्रमण पर डबल असहाय शाही सेना उपचार के प्रभाव के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. Luciferase की कमी अनुपचारित छोड़ दिया कोशिकाओं के सापेक्ष संक्रमण पर कोई प्रभाव नहीं है. वायरस हरी = नाभिक = नीला. चित्रा 5 βgal प्रोटीन की नॉकडाउन संक्रमण में कमी के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, के बाद से परख βgal प्रोटीन के स्तर का उपयोग करता है के रूप में एक संक्रमण के बाहर पढ़ने. संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत में कमी में βgal परिणाम की कमी. वायरस हरी = नाभिक = नीला. चित्रा 6 संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत में कमी में सेलुलर कारक Rab5 परिणाम के नॉकडाउन. चूंकि Rab5 endocytosis में भाग लेने के लिए जाना जाता है, इस पहलू की संभावना चेचक वायरस प्रविष्टि के लिए योगदान देता है. यह स्क्रीन से एक उदाहरण ग़ैर का प्रतिनिधित्व करता है. वायरस हरी = नाभिक = नीला.

Discussion

जीनोम चौड़ा आरएनएआई स्क्रीनिंग ड्रोसोफिला में वायरल संक्रमण के सेलुलर घटक जांच के लिए एक मजबूत और कारगर तरीका प्रदान करता है . स्तनधारी वायरस के एक नंबर ड्रोसोफिला कोशिकाओं, जो मेजबान आंतरिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के घटक है, और मेजबान प्रोटीन वायरल प्रतिकृति है कि उपन्यास चिकित्सात्मक लक्ष्य का प्रतिनिधित्व कर सकते के लिए आवश्यक कारक की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है संक्रमित. एक स्क्रीन प्रदर्शन से पहले, ध्यान से परख कोशिका प्रकार, सेल नंबर, और संक्रमण के स्तर के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, और अच्छी तरह से सकारात्मक और नकारात्मक दोनों वायरल ^और सेलुलर लक्ष्य 11 सहित नियंत्रित करना चाहिए,. यह महत्वपूर्ण है कि सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के बीच पर्याप्त जुदाई स्क्रीनिंग के लिए पहले सुनिश्चित करने के लिए परख के गतिशील रेंज को अधिकतम. एक बार स्क्रीन प्रदर्शन किया गया है, उम्मीदवारों कार्यात्मक श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है निर्धारित करने के लिए जो मेजबान तंत्र संक्रमण के लिए योगदान. चेचक जैसे स्तनधारी वायरस के लिए, आरएनएआई द्वारा स्तनधारी homologs का योगदान माध्यमिक विश्लेषण के भाग के रूप में निर्धारित किया जाना चाहिए. साथ में ले ली, इन मजबूत स्क्रीनिंग तरीकों हमें जटिल तंत्र है जिसके द्वारा वायरस अपने मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए अनुमति देगा.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Cell culture
Schneider’s media		GIBCO	11720
GlutaMAX 100X		GIBCO	35050
Penicillin/streptomycin (pen/strep)		GIBCO	15140
Fetal Bovine Serum (FBS)		SIGMA	F6178
Screening
Genome-wide dsRNA library		Ambion
384 well plates, black with clear bottom		Corning	3712
Aluminum seals		Corning	6569
Clear seals		Denville	B1212-4
Well Mate		Matrix	201-10001
24 pin manifold		Drummond	3-000-101
Hoechst 33342		Sigma	B2261
Fluorescently-labeled secondary antibodies		Invitrogen
ImageXpressMicro automated microscope		Molecular Devices
MetaXpress image analysis software		Molecular Devices