Summary
这个协议描述鼠标髓母细胞瘤组织的隔离和分裂，并随后allografting到免疫功能低下的受体小鼠的肿瘤细胞，以开展二次髓母细胞瘤。
Abstract
髓母细胞瘤是最常见的小儿神经系统的肿瘤。小脑颗粒神经元前体（CGNPs）1-4为髓母细胞瘤细 胞的原产地集中于动物研究的一个庞大的身躯。然而，在人类患者（结节，促纤维增生，古典和大细胞/间变性），而事实上，在没有CGNP标记5的异位表达的人类患者的一个子集发现髓母细胞瘤是，髓母细胞瘤亚型的不同临床表现表明，髓母细胞瘤细胞和分子的起源更复杂，远未完全破译。因此，它是必不可少的，以确定是否有替代髓母细胞瘤肿瘤细胞的起源细胞类型，具体的治疗方法可以开发基于。为此，颅内原位基因标记的肿瘤细胞类型肿瘤的发展中，收件人的后续分析allografting将使测定肿瘤细胞的细胞来源。在这里，我们描述了颅内原位allografting髓母细胞瘤细胞从原发肿瘤组织的实验协议，这个过程也可以用于移植建立细胞株的细胞。
Protocol
1。荷瘤小脑和肿瘤组织中的分离的显微解剖
- 检索肿瘤组织
- 轴承髓母细胞瘤的患病老鼠往往runted，并显示脑积水和典型的神经症状，包括瘫痪后未能收复当朝天的姿势。要检索肿瘤组织，安乐死小鼠吸入二氧化碳。这是项重要的，不执行颈椎脱位，程序产生的压力后的头骨，并能破坏肿瘤组织的完整性。
- 斩首是死亡后，立即用一把剪刀，头发和肌肉组织，尽可能消除良好的可视化的头骨。清洁的头骨表面用95％乙醇浸泡Kimwipe。
- 用细剪刀削减开放沿着头骨中线，然后取出用细镊子，在这一点荷瘤全脑包括小脑暴露颅骨组织。
- 虽然健康成人小脑显示定义的半球和蚓部，荷瘤小鼠的小脑往往是一个光滑的表面和突出的血管扩大，无定形。使用无菌技术，检索使用镊子在冰冷的磷酸盐和地方的小脑肿瘤缓冲无镁液（PBS）+和Ca 2 +。
注：所有的仪器都在95％的乙醇，并在使用前高压灭菌蒸汽进行消毒。 - 肿瘤组织离解
- 转移的肿瘤组织从PBS，以50％的Accutase（PBS稀释）的4倍左右的肿瘤组织的体积，组织讳言罚款剪刀为3分钟，在室温下孵育其次，在37 ° C，4分钟之后，该组织经过额外3分钟1毫升Pipetman重复pipeting。这种方法应该产生一个单细胞和小细胞聚集的混合物。
- 稀释的细胞悬浮在1000xg 5分钟沉淀细胞，用PBS离心3倍。 （上述程序已被形容“髓母细胞瘤干细胞的分离，浓缩和维护”，朱庇特在新闻）
重悬细胞沉淀在新鲜配制的神经干细胞Neurobasal培养基的组成与谷氨酰胺，青霉素，链霉素，氮，B27，人类表皮生长因子（25毫微克/毫升）和基本的FGF（25毫微克/毫升）媒介。计算细胞密度的解决方案，并作出适当的进一步稀释，与其他神经干细胞的培养基可以载入适当数量的游离肿瘤细胞，如5X10 5 4μL的解决方案，成为一个无菌的锥尖10μL注射器。接种细胞的确切数目，应确定由研究人员根据具体的实验要求。保持在一个小型的200μL的离心管的细胞溶液（PCR管）在冰上。
2。麻醉剂受体小鼠的程序
对于外科手术，消毒面积灭鼠手术是需要过程的持续时间。理想的情况下，为动物准备，经营领域和动物恢复独立，但毗邻地区成立一个长板凳。外科手套，手套不考试，需要手术。保持无菌技术操作，戴手套的手，腰部以上的，仅用于干燥无菌表面处理无菌对象。
- 用于麻醉氯胺酮（鼠标重量每公斤100毫克氯胺酮）和甲苯噻嗪（鼠标的重量每公斤10毫克甲苯噻嗪）的混合物。管理麻醉药腹腔。
- 它一般需要3-5分钟麻醉药充分的效果。判断鼠标是否完全麻醉脚趾/尾掐。将少量眼药膏对鼠标的眼睛。带来的完全麻醉的鼠标操作区，不断监测，以确保鼠标正常呼吸。
3。颅内移植的肿瘤细胞
- 剃须鼠标的背后的头地区，使用推剪，来揭示脑和小脑以上后的头骨。
- 申请使用棉花尖端涂药，用酒精垫擦拭就暴露出来了头皮优碘的解决方案。重复这两个步骤消毒两次。
- 请在四分之一英寸的切口后用消毒手术刀头皮。钻一个0.5毫米的毛刺孔的权利2毫米和2毫米，后用消毒的牙钻的lambda。
- 鼠标放置到一个立体的框架，通过连接到帧保持其门牙。仔细下降和定位锥尖10μL注射器装载4μL到毛刺洞肿瘤细胞的解决方案。一旦注射器针头斜角低于颅骨表面，Descend另外3毫米，然后登上0.5毫米。慢慢地注入肿瘤细胞所需的金额，在30秒的时间框架的稳定力量，进入收件人的小脑。完成增加一个两分钟的注射针后，留在其地方。然后取出针头和注射器。使用autoclip剪辑的伤口。
- 在手术后的升温毯保持鼠标，以帮助保持其体温。移动和呼吸模式将持续观察。一旦小鼠从麻醉中复苏，放置在无菌住房笼。监察日常食物和水的摄入量，行为，仪容，眼睛红染色。检查切口部位感染的迹象。取出手术后7天autoclips。
为2-6个月的平均保持在小鼠和牺牲者作进一步的研究显示典型的髓母细胞瘤的症状。
4。代表性的成果
在受体小鼠中开发的二次髓母细胞瘤非常相似的原发肿瘤的。轴承继发性肿瘤的小脑时往往扩大异位血管明显的无定形全坐骑观看。继发性肿瘤组织的免疫组织化学分析显示，肿瘤细胞高度增生，对此表示强烈SmoM2 - YFP和小脑颗粒神经元前体，如Math1和PAX6标志物。当分离和培养使用方法（“分离，浓缩和维护髓母细胞瘤干细胞”，按朱庇特 ），二级髓母细胞瘤肿瘤细胞可迅速扩大，表达多种干细胞标记物，克隆形成，并可以进一步启动肿瘤形成时移植到其他免疫功能低下受助。
图1。典型的整体式和分段一所中学的髓母细胞瘤组织的意见
一个典型的例子中学髓母细胞瘤组织开发的5X10 5原发肿瘤细胞注射后26天。苏木素染色，揭示了典型的髓母细胞瘤细胞形态，包括高核/质比和核多态性。这些继发性肿瘤细胞高度增生，Ki67表达表示，他们也有力表达膜SmoM2 - YFP。
图2。中学髓母细胞瘤细 胞可以在体外培养和扩大
使用鼠标主髓母细胞瘤细胞（“分离，浓缩和维护髓母细胞瘤干细胞”，按朱庇特）所描述的协议，这些中学的髓母细胞瘤细胞可以培养和扩大，为多个段落。图为代表在4天，14天培养的肿瘤细胞集落。培养的肿瘤细胞，双极性，用很少的细胞质和辐射往往从一个细胞总量的致密核心拉长。他们没有表现出生长接触抑制。小圆细胞是红细胞。
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Discussion
几个关键因素，以确保成功的髓母细胞瘤细胞allografting，产生继发性肿瘤的形成如下：首先，用于组织解离，只有50％Accutase和不过消化的组织，作为长期的酶处理细胞活力显着降低。另外，只使用1毫升的大小Pipetman较小的提示，还可以生成游离细胞的物理损坏。它是好的，有单个细胞和小allografting聚集的混合物。二，混合和平衡的肿瘤细胞的解决方案，每次装货前汉密尔顿注射器。不要使用超过4μL，每次注射量较大，会产生太多颅内压力和阻力。最后，重要的是等待一个额外的2分钟，让注入的解决方案散放每次注射后的小脑组织。
此处描述的步骤，允许的基因标记的细胞类型（S）的决心，可以启动和传播肿瘤。该协议也适用于被注入的细胞不直接来自原发肿瘤组织的情况，但是从既定的培养细胞系。任内切酶消化和/或重复吹打，人们可以准备适当数量的细胞，并开始从本议定书第2步。因此，我们还可以测试的候选基因的功能和抑制作用的化学化合物在体内肿瘤生长的读数。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是由Vanderbilt - Ingram癌症中心支援津贴（P30 CA068485），儿童脑瘤基金会和美国国立卫生研究院（NS042205）的赠款支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | 51730 | |
| Foredom flexible shaft drill, hang-up style | Stoelting Co. | 58650 | |
| Large probe holder | Stoelting Co. | 51633 | |
| 10 μL syringe, 26 ga., bevel tip | Stoelting Co. | 51105 | |
| Drill bit .75mm | Stoelting Co. | 51455-3 |
References
- Schuller, U. Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma. Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).
- Yang, Z. J. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Kessler, J. D. N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma. Genes Dev. 23, 157-170 (2009).
- Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
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