Um Ex-ovo Sistema de Cultura de embriões de frango Indicado para aplicações de imagem e Microcirurgia
Summary
Neste artigo, apresentamos uma metodologia simples para ativar a longo prazo<em> Ex-ovo</em> Cultura de embriões de aves. Esta técnica é ideal para a experimentação longitudinal exigindo acessibilidade óptico completo e / ou transporte estéril em embriões de aves.
Abstract
Compreender as relações entre fatores genéticos e microambientais que a unidade normal e malformados desenvolvimento embrionário é fundamental para descobrir novas estratégias terapêuticas. Avanços na tecnologia de imagem têm permitido investigação quantitativa da organização e amadurecimento do plano do corpo, mas numa fase posterior morfogênese embrionária é menos clara. Embriões de galinha são um atrativo vertebrados sistema modelo animal para esta aplicação devido à sua facilidade de cultura e manipulação cirúrgica. Embriões podem ser cultivadas por um curto período em anéis de papel de filtro, que permite acesso óptico completo para padronização celular e 1,2 estudos destino. Estudar processos avançados de desenvolvimento, como a morfogênese cardíaca são tradicionalmente realizada através de uma janela da casca do ovo 3-5, mas esta técnica limita o acesso óptico devido ao tamanho da janela. Nós já desenvolveu um método simples para a cultura de todo o embrião ex-ovo no hexagonal pesar barcos para até 10 dias, o que permitiu imagens de alta resolução através de ultra-sonografia 6,7. Essas culturas foram difíceis de transportar, limitando os tipos de ferramentas de imagem disponíveis para experimentos ao vivo. Nós aqui apresentar um sistema de cultura melhorou shell-less com um custo-benefício, a câmara portátil ambiental. Os ovos estavam rachados em uma rede criada por uma membrana de poliuretano (filme plástico) aposta circunferencialmente para um copo de plástico parcialmente cheio com água estéril. As dimensões da circunferência ea profundidade da rede eram fundamentais para manter a tensão superficial, enquanto os mecânicos da rede e água abaixo ajudou amortecem as vibrações induzidas por transporte. A pegada pequena circulação banho de água também foi desenvolvido para permitir o controle de temperatura contínua durante a experimentação. Nós demonstramos a capacidade de cultura de embriões, desta forma, pelo menos, 14 dias sem defeito ou atraso morfogênicos e empregar este sistema em vários de microcirurgia e aplicações de imagem.
Protocol
Discussion
Acesso óptico e experimentação em embriões de aves é um desafio devido às limitações da casca do ovo. Windowing limita significativamente o número de microvasos acessível para injeção e abordagens microcirúrgicas 8. Como resultado, apenas embriões podem ser manipulados e observação contínua não é possível. Início ex-ovo culturas usando placas de Petri eram de uso limitado por causa do controle inadequado da tensão superficial sobre o embrião impediu a cultura a longo prazo <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fertile white Leghorn chicken eggs | ||||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | ||||
| Saran Wrap | ||||
| Kimwipes | Kimberly-Clark, Inc. | |||
| Rubber bands | ||||
| Warm sterile water | ||||
| 9 oz plastic cup | ||||
| 100 mm diameter Petri dish | ||||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing CO, Savannah GA | |||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma Aldrich Inc. | |||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | |||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | ||||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Sarasota FL | Model M3301L | ||
| Fluorescent microscopy | Zeiss | Z20 | ||
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Sarasota FL | |||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | |||
| Tubing | VWR | 1mm OD | ||
| 3 mL syringe | BD | |||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR |
References
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