Vi har härledda en strategi för att upptäcka sekventiell inkorporering av tymidinanaloger (CldU och IDU) i vävnader hos vuxna möss att kvantifiera två på varandra följande rundorna av celldelning. Denna strategi är användbar för att identifiera celler omsättning långlivade vävnader, onkogena omvandling eller transitering-förstärkning celler.
Noggrann mätning av celldelning är en grundläggande utmaning i den experimentella biologin som blir allt mer komplex när långsamt delande celler analyseras. Etablerade metoder för att upptäcka celldelning inkluderar direkt visualisering av kontinuerlig mikroskopi i cellkultur, spädning av avgörande färgämnen som carboxyfluorescein di-Aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detektering av mitogena antigener som Ki67 eller PCNA, och analoger tymidin. Tymidinanaloger kan upptäckas genom en rad olika metoder inklusive radio-detektion för tritiated tymidin, immuno-detektering för bromo-deoxiuridin (BrdU), klor-deoxiuridin (CldU) och jod-deoxiuridin (IDU) och kemisk detektion för etinyl-deoxiuridin (EDU). Vi har härledda en strategi för att upptäcka sekventiell integrering av olika tymidinanaloger (CldU och IDU) i vävnader hos vuxna möss. Vår metod gör att utredarna att exakt kvantifiera två på varandra följande rundorna av celldelning. Genom att optimera immunfärgning protokoll vår metod kan upptäcka mycket låga analoger dos tymidin administreras via dricksvattnet, säker att administrera till möss under längre perioder. Därför kan vår teknik användas för att upptäcka cell omsättning i mycket långlivade vävnader. Optimal immunofluoresent färgning resultat kan uppnås i flera vävnadstyper, inklusive bukspottkörteln, hud, tarm, lever, binjurar, testiklar, äggstockar, sköldkörtel, lymfknutor, och hjärna. Vi har också tillämpat denna teknik för att identifiera onkogena omvandling inom vävnader. Vi har vidare tillämpat denna teknik för att avgöra om transit-förstärkning celler bidrar till tillväxt och förnyelse av vävnader. I denna mening representerar sekventiell tillförsel av tymidinanaloger en ny metod för att studera uppkomst och överlevnad av celler som deltar i vävnaden homeostas.
Vårt förhållningssätt till tymidin metod för märkning av celler omsättningen har många potentiella tillämpningar inom biomedicinsk forskning. Hittills har vi koncentrerat oss på bukspottkörteln, men vi har också tillämpat denna strategi för att undersöka cell omsättning i hud, tarm, lever, binjure, njurar, testiklar, äggstockar, sköldkörtel, lymfknutor, blodbildningen, och hjärnan 1. Eftersom cell omsättning varierar från vävnad till vävnad, bör märkning strategier anpassas för att få de mest övertygande information från orgeln av intresse. Morrison och kollegor använde CldU och IDU för 1 dag varje att märka blodbildningen 2. Kuhn och kollegor använder CldU och IDU för 4 dagar vardera för att upptäcka celldelning i regenererande myokardiet 3. Däremot har vi använt CldU och IDU upp till 9 månader totalt att märka basalcellscancer omsättning inom pankreasöarna, en vävnad med minimal cell omsättning djuret åldrarna 1,4-6. Den mest uppenbara potentiella tillämpningen av vår märkning strategi för studier för att definiera cell omsättning inom mjukpapper homeostas. Men vår teknik har flera andra potentiella tillämpningar. Till exempel har vi nyligen också tillämpat denna teknik för att identifiera onkogena omvandling i vävnader, där fokusområdena av ökad replikering kan lätt identifieras genom ökad integrering av CldU eller IDU 5. Morrison och kollegor använde CldU och IDU för 1 dag varje för att testa för etikett behålla beteendet hos hematopoetiska stamceller 2. Vi har också ansökt sekventiell märkning tymidinanalog att avgöra om transit-förstärkning celler bidrar till tillväxt och förnyelse av vävnader 1. I denna ansökan sekventiell tillförsel av tymidinanaloger representerar en ny metod för att studera uppkomst och överlevnad av celler som deltar i vävnaden homeostas.
Tymidinanaloger bör inte användas utan försiktighet. Syntetiska tymidinanaloger har potential toxicitet på delande celler, och deras användning kan teoretiskt påverka cellens omsättning på växande djur. Tymidinanaloger har använts som radiosensitizing agenter för cancerpatienter och kan bromsa cellens omsättning. Således uppmanar vi utredarna att försiktigt undersöka potentiella toxicitet i deras vävnad av intresse. Till exempel Trumpp och kollegor tycker att systemisk BrdU kan tvinga hematopoetiska stamceller in cellcykeln 7. Till exempel observerade Rutter och kollegor att hög dos tymidinanaloger är giftiga att utveckla bukspottkörteln 8. På senare tid Hellerstein och kollegor vid KineMed fann Inc att BrdU administrationen bromsar inom holmen spridning med 16-25% hjälp av en egenutvecklad tungt teknik vatten märkning 9. Hela holmen preparat som används av Hellerstein och kollegor innehöll många andra endokrina och icke-endokrina celltyper, som kan omfatta så mycket som 50% av det totala holme preparat. Däremot finner vi att långvarig infusion av BrdU inte påverkar beta-cellproliferation hos unga vuxna möss, mätt som Ki67 uttryck 4. Likaså verkar långsiktig förvaltning av CldU och injektionsmissbrukare inte försämra beta-expansionen cellmassan 1. Dessutom beta cellproliferation priser är likvärdiga mellan möss märkt med BrdU under lång tid och möss som endast är märkta för ett par timmar (priser är normaliserat till motsvarande tidsperioder). Tillsammans utgör dessa resultat tyder på att möss säkert tål långsiktigt låg dosering av tymidinanaloger. Ändå kan vi inte utesluta potentiella toxiciteten av tymidinanaloger i bukspottkörteln celltillväxt. Som ett resultat, fortsätter vi att utföra kontroller vid märkning möss med tymidinanaloger, och uppmana andra forskare att göra det också.
Vår teknik för sekventiell tymidinanalog märkning är inte utan fallgropar och tekniska utmaningar. Som ett resultat kontrollglas är särskilt viktiga. Vi har genererat kontroll bilder som består av olika vävnader från 1) Möss som bara var märkta med CldU,.. 2) Möss som bara var märkta med IDU;. 3) Möss som sekventiellt var märkta med CldU och sedan IDU,. 4) möss som sekventiellt var märkta i omvänd ordning, först med IDU och sedan CldU;. 5) Möss som hånar märkta med bara vatten. När lära sig etikett med CldU och IDU bör utredare utför alltid ut hela protokollet med alla 5 ovan uppsättningar av bilder från vävnaden av intresse.
Lätt korsreaktivitet mellan CldU och injektionsmissbrukare är ett olyckligt men oundvikligt nackdelen med märkning med båda tymidinanaloger. Den CldU och IDU Tekniken bygger på skillnader i släktskap mellan antiserum som ursprungligen härrör mot BrdU i olika arter (mus och råtta). Vår protokoll, medan besvärligt, är utformad för att minimera dessa korsreaktivitet. Därför uppmanar vi försiktighet bland utredare som anser att hoppa över steget (er) i protokollet. Framför allt har vistött på problem med sekundär antisera som korsreaktivt mellan mus och råtta. Detta kan minimeras genom att använda Jackson antiserum som är fullständigt över adsorberade mellan mus och råtta.
Vi misslyckas ibland för att adekvat upptäcka thymidinupptag. I sådana fall är det oerhört viktigt att använda positiva kontrollglas att avgöra vilket reagens eller steget inte fungerade. Svårigheterna är oftast på grund av dåligt alikvoter av antiserum, torr diabilder, eller otillräcklig kärnkraft permeabilization. Vi har misslyckats med att framgångsrikt etikett utveckla embryon med IDU. Således kan inte alla vävnader genomsläpplig för IDU.
Alternativ till CldU och IDU för dubbel tymidinanalog märkning är vid horisonten. EDU (5-etinyl-2 deoxiuridin) kan vara ett substrat för koppar katalyseras klicka kemi upptäckt 10,11. Edu detektionsmetoder inte kräver separation av DNA-strängar, och är därmed mycket tillgängliga för analys med flödescytometri 12. Edu är förenlig men inte korsreaktivt med BrdU 10. Edu har använts för att kvantifiera cell omsättning av olika mus vävnader inklusive betaceller i bukspottkörteln 13, intestinal L celler 14 och Epidermis 15. Edu är ganska dyrt för tillfället ($ 1000 US per 500mg). Ändå verkar Edu upptäckt vara mycket mer känsliga än BrdU upptäckt 10. Således kan det vara ekonomiskt möjligt att kombinera EDU och BrdU istället för CldU och IDU. Denna metod kan också möjliggöra upptäckt av tre olika rundor av celldelning hos möss triply märkta för Edu, CldU och IDU.
Sammanfattningsvis är vår teknik för sekventiell tymidinanalog märkning en ny metod för att upptäcka cell omsättning. Vi hoppas att vårt arbetssätt gör det möjligt för andra forskare att mer exakt kvantifiera celldelning, och räknar med att den kommer att öppna nya paradigm i vävnad homeostas.
The authors have nothing to disclose.
Stöds av JDRF, NIH (R01-DK081469), Commonwealth of Pennsylvania (Center for Excellence inom regenerativ medicin bevilja 4100043362), den March of Dimes (Basil O'Connor Startat Scholar Research Award) och ett University of Pennsylvania DERC pilotprojekt och genomförbarhet bidrag (DK19525).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
5-chloro-2-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedical | 0210547891 | ||
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | MP Biomedical | 0210035701 | ||
4% Paraformaldehyde | USB | 19943 | ||
10% Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | ||
XYLENES | VWR | EM-XX0060-4 | ||
Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | ||
PBS, 10X Powder Concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | ||
Triton –X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | ||
Hydrochloric Acid | VWR | BDH3028-2.5LG | ||
Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | ||
Mouse Anti BrdU | BD Pharmingen | 347580 | ||
Rat mab anti BrdU | Accurate Chemical | OBT0030 | ||
Cy2 donkey anti-rat | Jackson Immuno | 712-225-153 | Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity). | |
Cy5 donkey anti-mouse | Jackson immuno | 715-175-151 | See above | |
Glass Cover Slips | Sigma-Aldrich | C9056-1CS | ||
YFP Filter | Chroma | 49003 ET EYFP | Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel | |
Cy3 Filter | Chroma | 49004 ET Cy3 | ||
Cy5 Filter | Chroma | 49006 ET Cy5 | ||
ORCA ER Microscope Camera | Hamamatsu | C4742-95-12ER | Excellent detection of fluorophores | |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes). |