दो thymidine analogues के Immunofluorescent प्राथमिक ऊतक में (CldU और IDU) डिटेक्शन
Summary
हम एक वयस्क चूहों के ऊतकों में कोशिका विभाजन के लगातार दो राउंड यों thymidine analogues के अनुक्रमिक निगमन (CldU और IDU) का पता लगाने के लिए रणनीति निकाली गई है. यह रणनीति लंबे समय रहते ऊतकों की कोशिका कारोबार oncogenic परिवर्तन, या पारगमन amplifying कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उपयोगी है.
Abstract
कोशिका विभाजन के सटीक माप प्रायोगिक जीव विज्ञान में एक मौलिक चुनौती है कि तेजी से जटिल है जब धीरे धीरे कोशिकाओं को विभाजित विश्लेषण कर रहे हैं हो जाता है. स्थापित करने के लिए कोशिका विभाजन का पता लगाने के तरीकों सेल संस्कृति, carboxyfluorescein di-aetate succinimidyl (CFSE) एस्टर, जैसे ki67 या PCNA mitogenic प्रतिजनों के इम्युनो – पता लगाने जैसे महत्वपूर्ण रंगों के कमजोर पड़ने, और thymidine analogues में निरंतर माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्यक्ष दृश्य शामिल हैं. Thymidine analogues tritiated thymidine, इम्युनो – ब्रोमो (BrdU) deoxyuridine, क्लोरोफ्लूरोकार्बन deoxyuridine (CldU) और iodo deoxyuridine (IDU) के लिए पता लगाने और ethinyl – deoxyuridine के लिए रासायनिक पता लगाने के लिए रेडियो का पता लगाने सहित तरीकों की एक किस्म के द्वारा पता लगाया जा सकता है (EDU). हम एक वयस्क चूहों के ऊतकों में अलग thymidine analogues के अनुक्रमिक निगमन (CldU और IDU) का पता लगाने की रणनीति निकाली गई है. हमारे विधि जांचकर्ताओं सही कोशिका विभाजन के लगातार दो दौर मात्रा ठहराना करने के लिए अनुमति देता है. Immunostaining अनुकूलन प्रोटोकॉल करके हमारे दृष्टिकोण बहुत कम खुराक thymidine analogues के पीने के पानी, सुरक्षित के माध्यम से प्रशासित करने के लिए समय की लंबी अवधि के लिए चूहों के लिए प्रशासन का पता लगा सकते हैं. नतीजतन, हमारी तकनीक बहुत लंबे समय रहते ऊतकों में कोशिका कारोबार का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इष्टतम immunofluoresent धुंधला परिणाम अग्न्याशय, त्वचा, पेट, यकृत, अधिवृक्क, वृषण, अंडाशय, थायराइड, लिम्फ नोड, और मस्तिष्क सहित कई प्रकार के ऊतकों में प्राप्त किया जा सकता है. हम भी इस तकनीक को लागू किया है ऊतकों के भीतर oncogenic परिवर्तन की पहचान. हम आगे इस तकनीक लागू करने के लिए निर्धारित करती है कि पारगमन-amplifying कोशिकाओं या ऊतकों के विकास और नवीकरण के लिए योगदान दिया है. इस अर्थ में, thymidine analogues के अनुक्रमिक प्रशासन और ऊतक homeostasis में शामिल कोशिकाओं के मूल अस्तित्व के अध्ययन के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है.
Protocol
Discussion
हमारे सेल कारोबार लेबलिंग thymidine आधारित दृष्टिकोण के लिए दृष्टिकोण जैव चिकित्सा अनुसंधान में कई संभावित अनुप्रयोगों है. तिथि करने के लिए, हम अग्न्याशय पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन हम भी इस रणनीति लागू करने के लिए त्वचा की कोशिका कारोबार, पेट, यकृत, अधिवृक्क, गुर्दे, वृषण, अंडाशय, थायराइड, लिम्फ नोड, hematopoiesis, और एक मस्तिष्क की जांच . क्योंकि सेल कारोबार ऊतक से ऊतकों को बदलता है, रणनीतियों लेबलिंग हित के अंग से सबसे सम्मोहक जानकारी प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. मॉरिसन और उनके सहयोगियों ने 1 दिन प्रत्येक hematopoiesis 2 लेबल के लिए CldU और IDU इस्तेमाल किया. Kuhn और उनके सहयोगियों ने 4 दिनों के लिए प्रत्येक CldU और IDU उपयोग regenerating मायोकार्डियम में 3 कोशिका विभाजन का पता लगाने. इसके विपरीत, हम CldU और IDU 9 जानवर 1,4-6 उम्र के रूप में कम से कम सेल कारोबार के साथ अग्नाशय islets, एक ऊतक के भीतर बेसल सेल कारोबार लेबल कुल महीने के लिए इस्तेमाल किया है. हमारे लेबलिंग रणनीति का सबसे स्पष्ट संभावित आवेदन के लिए अध्ययन ऊतक homeostasis के भीतर सेल कारोबार को परिभाषित करने के लिए. लेकिन हमारी तकनीक कई अन्य संभावित अनुप्रयोगों है. उदाहरण के लिए, हम भी हाल ही में इस तकनीक लागू करने के लिए ऊतकों के भीतर oncogenic परिवर्तन, जहाँ वृद्धि की प्रतिकृति का फोकल क्षेत्रों CldU या IDU 5 की वृद्धि निगमन द्वारा आसानी से पहचाना जा सकता है है की पहचान. मॉरिसन और उनके सहयोगियों ने 1 दिन प्रत्येक लेबल hematopoietic स्टेम सेल के व्यवहार को बनाए रखना 2 के लिए परीक्षण के लिए CldU और IDU इस्तेमाल किया. हम भी अनुक्रमिक thymidine अनुरूप निर्धारित करने के लिए अगर पारगमन-amplifying कोशिकाओं या ऊतकों 1 के विकास और नवीकरण के लिए योगदान लेबलिंग लागू है . Thymidine analogues के इस आवेदन अनुक्रमिक प्रशासन और ऊतक homeostasis में शामिल कोशिकाओं के मूल अस्तित्व के अध्ययन के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है.
Thymidine analogues सावधानी के बिना नहीं किया जाना चाहिए. सिंथेटिक thymidine analogues कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए संभावित toxicities है, और उनके उपयोग सैद्धांतिक रूप से बढ़ रही पशुओं में सेल कारोबार प्रभावित हो सकती है. Thymidine analogues के कैंसर रोगियों के लिए एजेंट radiosensitizing के रूप में इस्तेमाल किया गया है, और सेल कारोबार धीमा हो सकता है है. इस प्रकार हम सावधानी से ब्याज की उनके ऊतकों में संभावित toxicities के लिए जांच के लिए जांचकर्ताओं से आग्रह करता हूं. उदाहरण के लिए, Trumpp और उनके सहयोगियों को लगता है कि प्रणालीगत BrdU hematopoietic स्टेम सेल सेल 7 चक्र में प्रवेश करने के लिए मजबूर कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, Rutter और उनके सहयोगियों ने कहा कि उच्च खुराक thymidine analogues 8 अग्न्याशय के विकास के लिए विषाक्त कर रहे हैं. हाल ही में Hellerstein और KineMed सहयोगियों, इंक में पाया गया कि BrdU प्रशासन अंतर आइलेट प्रसार 16-25% द्वारा एक मालिकाना भारी पानी लेबलिंग 9 तकनीक का उपयोग कर धीमा कर देती है. पूरे आइलेट Hellerstein और उनके सहयोगियों के द्वारा प्रयोग किया जाता तैयारी कई अन्य endocrine और गैर endocrine सेल प्रकार है, जो कुल आइलेट तैयारी के जितना 50% शामिल सकता है निहित. हालांकि, हम पाते हैं BrdU की है कि लंबे समय तक प्रेरणा युवा वयस्क चूहों में बीटा सेल प्रसार को प्रभावित नहीं करता है, के रूप में ki67 4 अभिव्यक्ति द्वारा मापा. इसी तरह, CldU और IDU के लंबे समय तक प्रशासन बीटा सेल जन विस्तार 1 ख़राब नहीं लगती. इसके अलावा, बीटा सेल प्रसार दर समय और चूहों कि केवल कुछ घंटे (दरों बराबर समय अवधि के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं) के लिए चिह्नित कर रहे हैं की लंबी अवधि के के लिए BrdU लेबल के साथ चूहों के बीच में बराबर हैं. साथ में, इन परिणामों का सुझाव है कि चूहों को सुरक्षित रूप से लंबी अवधि के thymidine analogues के कम खुराक प्रशासन बर्दाश्त कर सकते हैं. फिर भी, हम बाहर अग्नाशय बीटा सेल के विकास में thymidine analogues द्वारा संभावित विषाक्तता नहीं शासन कर सकते हैं. एक परिणाम के रूप में, हम करने के लिए नियंत्रण प्रदर्शन जब thymidine analogues के साथ चूहों लेबलिंग, और अन्य जांचकर्ताओं के लिए इतनी के रूप में अच्छी तरह से करने के आग्रह करता हूं जारी है.
अनुक्रमिक thymidine एनालॉग लेबलिंग की हमारी तकनीक नुकसान और तकनीकी चुनौतियों के बिना नहीं है. एक परिणाम के रूप में, नियंत्रण स्लाइड विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं. हम नियंत्रण स्लाइड्स कि 1 से विभिन्न ऊतकों से मिलकर उत्पन्न किया है) चूहे कि केवल CldU साथ लेबल रहे थे;. 2) चूहे कि केवल IDU साथ लेबल रहे थे; 3) चूहे कि sequentially CldU और तब IDU के साथ लेबल रहे थे; 4) चूहे कि sequentially रिवर्स क्रम में लेबल थे, पहले IDU और तब CldU के साथ; 5) चूहे कि केवल पानी के साथ लेबल नकली हैं. जब CldU और IDU के साथ लेबल के लिए सीखने के लिए, जांचकर्ताओं हमेशा बाहर सभी 5 हित के ऊतकों से स्लाइड्स के ऊपर सेट के साथ पूरे प्रोटोकॉल ले.
CldU और IDU के बीच में थोड़ा सा पार जेट एक दुर्भाग्यपूर्ण लेकिन अपरिहार्य दोनों thymidine analogues के साथ लेबलिंग नकारात्मक पहलू है. CldU और IDU तकनीक समानताएं में antisera कि मूल रूप से विभिन्न प्रजातियों (माउस और चूहा) में थे BrdU के खिलाफ निकाली बीच में अंतर पर आधारित है. हमारी प्रोटोकॉल, बोझिल जबकि ऐसे पार जेट को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. नतीजतन, हम जो जांचकर्ताओं प्रोटोकॉल (ओं) के कदम लंघन पर विचार के बीच सावधानी से आग्रह करता हूं. विशेष रूप में, हम हैमाध्यमिक antisera के साथ समस्याओं का सामना करना पड़ा है कि माउस और चूहे के बीच में पार प्रतिक्रियाशील रहे हैं. यह है कि पूरी तरह से कर रहे हैं माउस और चूहे के बीच में पार adsorbed जैक्सन antisera के उपयोग द्वारा कम किया जा सकता है.
हम कभी कभी पर्याप्त thymidine निगमन का पता लगाने में विफल है. ऐसे मामलों में यह महत्वपूर्ण है सकारात्मक नियंत्रण स्लाइड्स का उपयोग करने के लिए निर्धारित है जो अभिकर्मक या कदम काम नहीं कर रहा था. कठिनाइयाँ आम तौर पर कर रहे हैं antisera, शुष्क स्लाइड्स, या अपर्याप्त परमाणु permeabilization का बुरा aliquots के कारण है. हम को सफलतापूर्वक IDU के साथ भ्रूण विकसित लेबल में विफल रहा है. इस प्रकार, सभी ऊतकों IDU के लिए पारगम्य नहीं हो सकता है.
डबल thymidine एनालॉग लेबलिंग के लिए CldU और IDU के लिए वैकल्पिक क्षितिज पर हैं. Edu (deoxyuridine 5 – ethinyl-2) तांबे उत्प्रेरित क्लिक रसायन शास्त्र 10,11 पता लगाने के लिए एक सब्सट्रेट किया जा सकता है . Edu तरीकों का पता लगाने डीएनए strands की जुदाई की आवश्यकता नहीं है, और इस प्रकार उच्च प्रवाह cytometry 12 से विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी हैं. Edu है लेकिन 10 BrdU के साथ प्रतिक्रियाशील पार संगत नहीं है . Edu सेल विभिन्न माउस के ऊतकों के अग्नाशय बीटा 13 कोशिकाओं, आंतों एल 14 कोशिकाओं और 15 epidermis सहित कारोबार यों इस्तेमाल किया गया है. Edu पल (500mg प्रति 1000 अमरीकी डॉलर) में काफी महंगा है. फिर भी, Edu पता लगाने के लिए अधिक BrdU पता लगाने की तुलना में 10 संवेदनशील प्रतीत होता है. इस प्रकार, यह आर्थिक Edu और CldU और IDU के बजाय BrdU गठबंधन संभव हो सकता है. Triply Edu, CldU, और IDU के लिए लेबल चूहों में कोशिका विभाजन के तीन अलग – अलग दौर की इस पद्धति का भी पता लगाने की अनुमति हो सकती है.
सारांश में, अनुक्रमिक thymidine एनालॉग लेबलिंग के बारे में हमारी तकनीक सेल कारोबार का पता लगाने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण है. हमें उम्मीद है कि हमारे दृष्टिकोण अन्य वैज्ञानिकों के लिए सक्षम बनाता है अधिक सही कोशिका विभाजन यों, और उम्मीद है कि यह ऊतकों homeostasis में नए मानदंड खुल जाएगा.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JDRF, एनआईएच (R01-DK081469), पेन्सिलवेनिया के राष्ट्रमंडल (पुनर्योजी चिकित्सा अनुदान 4100043362 में उत्कृष्टता के लिए केंद्र), ऑफ डाइम्स के मार्च (तुलसी O'Connor स्टार्टर विद्वान अनुसंधान पुरस्कार), और पेंसिल्वेनिया DERC पायलट के एक विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित और व्यवहार्यता अनुदान (DK19525).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5-chloro-2-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedical | 0210547891 | ||
| 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | MP Biomedical | 0210035701 | ||
| 4% Paraformaldehyde | USB | 19943 | ||
| 10% Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | ||
| XYLENES | VWR | EM-XX0060-4 | ||
| Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | ||
| PBS, 10X Powder Concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | ||
| Triton –X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | ||
| Hydrochloric Acid | VWR | BDH3028-2.5LG | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | ||
| Mouse Anti BrdU | BD Pharmingen | 347580 | ||
| Rat mab anti BrdU | Accurate Chemical | OBT0030 | ||
| Cy2 donkey anti-rat | Jackson Immuno | 712-225-153 | Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity). | |
| Cy5 donkey anti-mouse | Jackson immuno | 715-175-151 | See above | |
| Glass Cover Slips | Sigma-Aldrich | C9056-1CS | ||
| YFP Filter | Chroma | 49003 ET EYFP | Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel | |
| Cy3 Filter | Chroma | 49004 ET Cy3 | ||
| Cy5 Filter | Chroma | 49006 ET Cy5 | ||
| ORCA ER Microscope Camera | Hamamatsu | C4742-95-12ER | Excellent detection of fluorophores | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes). |
References
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