मानव अग्नाशय के कैंसर xenografts से स्टेम सेल के अलगाव

Summary

कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) दुर्दमताओं का एक संख्या में पहचान की गई है. इस प्रोटोकॉल में हम एक प्रवाह cytometric एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज गतिविधि और CD44 और CD24 अभिव्यक्ति का उपयोग मानव अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता xenografts से सीएससी अलग विधि का वर्णन. इन व्यवहार्य कोशिकाओं तो कार्यात्मक और विश्लेषणात्मक अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) दुर्दमताओं का एक बढ़ती संख्या में पहचान की गई है और कार्यात्मक उनके आत्म नवीकरण से गुजरना और ^{विभेदित} एक संतान का उत्पादन करने की क्षमता के द्वारा परिभाषित कर रहे हैं. इन गुणों के सीएससी मूल ट्यूमर पुनरावृत्ति जब immunocompromised चूहों में इंजेक्ट करने की अनुमति देते हैं. सीएससी एक उपकला द्रोह के भीतर पहली बार स्तन कैंसर में वर्णित किया गया और पाया विशिष्ट कोशिका की सतह प्रतिजन अभिव्यक्ति ^(CD44 + ^{CD24 कम / -)} प्रदर्शित ^करने के लिए 2. तब से, सीएससी अन्य मानव CD44 और CD24 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य सतह प्रतिजनों के एक नंबर का उपयोग malignancies की एक बढ़ती हुई संख्या में पहचान की गई है. एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज गतिविधि (ALDH) सहित शारीरिक गुण, भी घातक ऊतकों से ^3-5 सीएससी अलग इस्तेमाल किया गया है है.

हाल ही में, और हम दूसरों से सीएससी अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता ALDH गतिविधि और कोशिका की सतह CD44 और CD24, और ^6-8 CD133 प्रतिजनों की अभिव्यक्ति के आधार पर पहचान. ये अत्यधिक tumorigenic आबादी या हो सकता है अतिव्यापी सकता है और नहीं हो सकता है अन्य कार्यों को प्रदर्शित. हमने पाया है कि ALDH ⁺ और ​​CD44 CD24 ^{+ +} अग्नाशय सीएससी इसी तरह tumorigenic हैं, लेकिन ALDH ⁺ कोशिकाओं अपेक्षाकृत अधिक आक्रामक ^8. इस प्रोटोकॉल में हम कम बीतने मानव ⁹ xenografts से व्यवहार्य अग्नाशय सीएससी अलग विधि का वर्णन. Xenografted ट्यूमर चूहों से काटा जाता है और एक एकल कक्ष निलंबन में बनाया. ऊतक मलबे और मृत कोशिकाओं को जीवित कोशिकाओं से अलग हैं और फिर CD44 और CD24 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर और ^ALDEFLUOR अभिकर्मक, 10 ALDH की एक फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट का उपयोग दाग. सीएससी तो प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई के द्वारा अलग कर रहे हैं. आइसोलेटेड सीएससी तो व्यवहार्य कोशिकाओं की आवश्यकता होती है विश्लेषणात्मक या कार्यात्मक assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

1. चूहे से हार्वेस्ट xenografts Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण बछड़ा (FCS) के सीरम, पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, 200 यू / एमएल Collagenase प्रकार चतुर्थ, और 0.6 dispase U / एमएल के साथ पूरक: सेल हदबंदी बफर तैयार करें. एक athymic परमाणु (+ परमाणु / +) एक चमड़े के नीचे मानव अग्नाशय के कैंसर xenograft है कि सबसे बड़ा व्यास में कम से कम 1 सेमी है शरण माउस कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के द्वारा euthanized है. चमड़े के नीचे ट्यूमर माउस के पार्श्व से कुंद संदंश और कैंची का उपयोग विच्छेदन के द्वारा काटा जाता है और तुरंत सेल हदबंदी बफर में रखा. ट्यूमर तौला और ट्यूमर के ऊतक के 1 ग्राम प्रति 10 एमएल सेल हदबंदी बफर में वापस रखा. 2. Xenografts से एक एकल कोशिका सस्पेंशन उत्पन्न एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में कार्य करना, ट्यूमर एक 100 x सेल हदबंदी बफर के 1 एमएल के साथ 20 मिमी संस्कृति डिश को सौंप दिया है. ट्यूमर यंत्रवत् बाँझ रेज़र ब्लेड और संदंश का उपयोग कर कीमा बनाया हुआ हैं. ट्यूमर सेल निलंबन एक 5 एमएल सीरम वैज्ञानिक pipet के माध्यम से 10 गुना है triturated है. ट्यूमर के टुकड़े काफी छोटे 5 एमएल सीरम वैज्ञानिक pipet रोकना नहीं होना चाहिए. ट्यूमर सेल निलंबन एक 50 एमएल शंक्वाकार सेल हदबंदी बफर के शेष मात्रा (50% से कम भरा) युक्त ट्यूब को सौंप दिया है और 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर vortexed है. ट्यूमर सेल निलंबन तब डिग्री सेल्सियस 2 घंटे के लिए 1 मिनट हर 20 मिनट के लिए आंतरायिक vortexing के साथ 37 पर incubated. 3. ऊतक मलबे के सेल सस्पेंशन और मृत कोशिकाओं को चूस लेना 2 घंटे ऊष्मायन सेल निलंबन के बाद 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर vortexed है. सेल निलंबन तो एक 70-सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया है और एक ताजा 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एकत्र और ट्यूब प्रति 15 एमएल की अंतिम मात्रा को समायोजित. आगे की मृत कोशिकाओं और ऊतकों मलबे से अलग व्यवहार्य कोशिकाओं, ट्यूमर सेल निलंबन घनत्व Ficoll – Paque प्लस का उपयोग centrifugation द्वारा अलग है. Ficoll – Paque प्लस के एक underlayment प्लस सेल करने के लिए दो परतों मिश्रण नहीं सावधान किया जा रहा निलंबन के नीचे धीरे धीरे Ficoll – Paque के 15 एमएल pipeting के द्वारा बनाई गई है. सेल निलंबन और ब्रेक के साथ 30 मिनट के लिए Ficoll परतों है 500x जी पर centrifuged बंद कर दिया. Ficoll Paque प्लस और सेल हदबंदी बफर के इंटरफ़ेस में कक्ष एकत्र और एक ताजा 50-एमएल शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरित कर रहे हैं. ताजा DMEM FCS के 10% के साथ पूरक सेल निलंबन लिए जोड़ा जाता है इसे कमजोर 01:03 (जैसे 20 एमएल ताजा मीडिया सेल निलंबन के 10 एमएल). कोशिकाओं 450x जी पर centrifugation द्वारा 10 मिनट, decanted मीडिया के लिए एकत्र कर रहे हैं, और सेल गोली ALDEFLUOR बफर के 1 एमएल में resuspended है. सेल निलंबन के दस microliters 10 μL trypan नीले और व्यवहार्य एक hemocytometer गिनती का उपयोग कर रहे हैं कोशिकाओं के साथ पतला है. यदि मृत कोशिकाओं या ऊतकों मलबे की एक बड़ी संख्या में इस कदम के दौरान नोट कर रहे हैं, तो घनत्व centrifugation द्वारा सेल जुदाई (- 3.7 3.3 कदम) दोहराया जा सकता है. 4. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी के लिए कक्ष दाग लेबल सात 12 x 75 मिमी polystyrene के रूप में टेस्ट ट्यूब प्रकार है: अस्थिर CD44-APC CD24 – पीई CD31-बायोटिन + माउस वंश – बायोटिन + माउस एच 2Kd-बायोटिन माउस ALDEFLUOR ALDEFLUOR + DEAB + आईजीजी 2bκ-APC + आईजीजी 2aκ पीई ALDEFLUOR + CD44-APC + CD24 पीई + माउस CD31-बायोटिन + माउस वंश – बायोटिन + माउस एच 2Kd-बायोटिन. 5-10 लाख कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता ALDEFLUOR बफर के 2 एमएल में सेल निलंबन पतला और बर्फ पर रख. ट्यूबों # 1, 2, 3, और 4 के लिए सेल निलंबन के 100 μL जोड़ें और उन्हें बर्फ पर रख. # 6 ट्यूब के लिए 1 μL DEAB जोड़ें और बर्फ पर रख. शेष सेल 1000 पतला निलंबन को ALDEFLUOR अभिकर्मक जोड़ें – गुना (जैसे 1.6 एमएल सेल निलंबन के लिए 1.6 μL ALDEFLUOR अभिकर्मक जोड़ने), मिश्रण अच्छी तरह से, और बर्फ पर जगह. # 7 ट्यूब के लिए इस मिश्रण की 100 # 5 और 6 ट्यूबों μL, और शेष मिश्रण (1.4 एमएल) स्थानांतरण. 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूबों के सभी सेते हैं. सेल निलंबन हर 10 मिनट मिक्स आदेश में ट्यूबों के नीचे बसने से कोशिकाओं को रोकने. 450x जी कोशिकाओं और 4 अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट और फिर बफर छानना. 100 μL ALDEFLUOR बफर में # 1 और 5 ट्यूबों में छर्रों Resuspend. ट्यूबों # 2, 3, 4, और 6 के लिए, उपयुक्त निम्नानुसार पतला एंटीबॉडी युक्त ALDEFLUOR बफर के 100 μL जोड़ें: 2bΚ APC आईजीजी, 2aΚ पीई आईजीजी CD44 APC, और CD24 पीई के लिए 1:20एंटीबॉडी, 1:100 CD31-बायोटिन माउस के लिए, वंश – बायोटिन माउस, माउस और एच 2Kd-बायोटिन एंटीबॉडी. ट्यूब # 7 ALDEFLUOR बफर युक्त CD44-APC के 1:20 कमजोर पड़ने के 1.4 एमएल, और CD24-पीई एंटीबॉडी और एक 1:100 माउस के कमजोर पड़ने CD31 बायोटिन, जोड़ने के वंश बायोटिन माउस, और एच 2Kd बायोटिन माउस एंटीबॉडी. 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेल निलंबन सेते हैं. 450x जी कोशिकाओं और 4 अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट और फिर बफर छानना. छर्रों में # 1 ट्यूबों, 2, 3, 5, और 6 100 μL ALDEFLUOR बफर में Resuspend. ALDEFLUOR streptavidin-PerCP प्रोटीन का एक 1:100 कमजोर पड़ने वाले बफर की 1.5 एमएल तैयार करें. # 4 ट्यूब के लिए 100 μL जोड़ें और # 7 ट्यूब 1.4 एमएल जोड़ने. 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेल निलंबन सेते हैं. 450x जी कोशिकाओं और 4 अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट और फिर बफर छानना. छर्रों में # 1 ट्यूबों, 2, 3, 4, 5, और 6 200 μL ALDEFLUOR बफर में Resuspend. # 7 ALDEFLUOR बफर युक्त 2 μg / एमएल propidium आयोडाइड के 2.8 एमएल में ट्यूब में गोली Resuspend. सभी समय पर बर्फ पर ट्यूबों रखें. 35 सुक्ष्ममापी झरनी टोपियां के साथ 12 x 75 मिमी polystyrene टेस्ट ट्यूब का उपयोग फिल्टर के माध्यम से कोशिकाओं दर्रा. 5. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी द्वारा कैंसर स्टेम कोशिकाओं को अलग एक FACSAria प्रवाह cytometer सेल छँटाई के लिए तैयार है. मुआवजा नियंत्रण ट्यूबों # 1, 2, 3, 4, और 5 से कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए सेट कर रहे हैं. गेट्स आगे और पक्ष स्कैटर मापदंडों पर आधारित पैदा कर रहे हैं सेल singlets इकट्ठा. (PerCP नकारात्मक) गैर माउस और व्यवहार्य (गैर propidium आयोडाइड दाग) कोशिकाओं FL-3 चैनल का उपयोग gated हैं. ALDH + कोशिकाओं फाटकों पर आधारित एकत्र कर रहे हैं DEAB इलाज कोशिकाओं (# 6 ट्यूब) और FL एक चैनल का उपयोग कर बनाया. CD44 CD24 + + कोशिकाओं द्वार पर एकत्र कर रहे हैं आधारित ALDEFLUOR, 2bΚ APC आईजीजी और 2aκ पीई आईजीजी (# 6 ट्यूब) के साथ दाग कोशिकाओं FL-4 और FL – 2 चैनल का उपयोग कर का उपयोग कर बनाया. कक्ष 12 x 75 मिमी polystyrene परीक्षण DMEM के 1 एमएल FCS के साथ 10% पूरक युक्त ट्यूबों में एकत्र कर रहे हैं. बाद कोशिकाओं को हल किया गया है, 10 मिनट, छानना मीडिया के लिए 450x छ सेल निलंबन, अपकेंद्रित्र और 500 μL ताजा DMEM में कोशिकाओं resuspend FCS के साथ पूरक 10%. सॉर्ट किया गया एक के रूप में 3.8 चरण में वर्णित hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की संख्या गिनो. 6. प्रतिनिधि परिणाम इस प्रोटोकॉल ALDH + CD44 + CD24 + अग्नाशय सीएससी के अलगाव के लिए नेतृत्व करेंगे. माउस व्युत्पन्न कोशिकाओं का प्रतिशत चर रहा है, लेकिन हमने पाया है कि सबसे अधिक मानव अग्नाशय के कैंसर xenografts 20-60% होता है व्युत्पन्न माउस CD31 माउस का उपयोग कोशिकाओं, माउस वंश कॉकटेल, और माउस एच 2Kd बायोटिन – संयुग्मित एंटीबॉडी (चित्रा 1A है ). इसी तरह विभिन्न xenografts से प्रत्येक सीएससी जनसंख्या की आवृत्ति चर रहा है, लेकिन आम तौर पर हमने पाया है कि सेल की कुल जनसंख्या का 1-4% + ALDH (चित्रा 1 बी) है और 0.2-5% CD44 + + CD24 (चित्रा 1C ). हम नियमित मैन्युअल रूप से सॉर्ट किया गया hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती के बाद FACSAria मशीन मायने रखता है अक्सर गैर सेलुलर FACSAria द्वारा पता लगाया कणों की वजह गलत. चित्रा 1. प्रवाह cytometry साजिश अग्नाशय के कैंसर xenograft से विशिष्ट आबादी चित्रण (ए) FL 3 चैनल में सकारात्मक धुंधला कक्ष (propidium आयोडाइड + माउस माउस CD31 + वंश + या + एच 2Kd माउस) अपवर्जित कर रहे हैं के रूप में ही अलग करने के लिए. व्यवहार्य और गैर – माउस कोशिकाओं व्युत्पन्न. (बी) एक मानव अग्नाशय के कैंसर xenograft में ALDH गतिविधि प्रवाह और ALDH1 अवरोध करनेवाला diethylamino benzaldehyde (DEAB) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में ALDEFLUOR अभिकर्मक का उपयोग कर cytometry द्वारा मापा गया था. फ्रेम द्वार कि ALDH + कोशिकाओं कि DEAB के साथ इलाज किया कोशिकाओं के आधार पर बनाया गया था और तब अनुपचारित कोशिकाओं को लागू दर्शाती का प्रतिनिधित्व करते हैं . ALDH + कोशिकाओं के प्रतिशत के गेट में दिखाए जाते हैं . (सी) CD44 CD24 + + गेट ALDEFLUOR साथ दाग कोशिकाओं के आधार पर बनाया गया था, और एंटीबॉडी 2bκ APC आईजीजी (CD44-APC के लिए isotypic नियंत्रण) और 2aκ पीई आईजीजी (CD24 – पीई के लिए isotypic नियंत्रण) . CD44 CD24 + + कोशिकाओं के प्रतिशत के गेट में दिखाए जाते हैं .

Discussion

इस प्रोटोकॉल मानव xenografts से अग्नाशय के सीएससी के अलगाव का वर्णन करता है. इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम व्यवहार्य सीएससी की उपज में वृद्धि होगी. अग्नाशय के सीएससी की एक शुद्ध आबादी की वसूली व्यवहार्य FACSAria पर सॉर्ट करने से पहले सेल निलंबन में मौजूद कोशिकाओं की शुद्धता पर निर्भर है. देखभाल xenografts है कि सबसे बड़ा व्यास में 1 सेमी से कम कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए ट्यूमर के केंद्र में परिगलित ऊतक की मात्रा को कम करने में मदद करता है. इसके अतिरिक्त, Ficoll Paque ढाल centrifugation के दौरान ऊतक मलबे और मृत कोशिकाओं के सेल निलंबन घट महत्वपूर्ण है और अगर ऊतक मलबे या गैर – व्यवहार्य कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या जब कोशिकाओं hemocytometer पर गिना जाता है पता चला रहे हैं दोहराया जा सकता है है.

धुंधला प्रोटोकॉल का वर्णन यहाँ ALDEFLUOR अभिकर्मक प्रणाली का इस्तेमाल करने के लिए ALDH के रूप में अच्छी तरह के रूप में गतिविधि fluorophore – संयुग्मित एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए विशेष सेल की सतह प्रतिजनों का पता लगाने. ALDEFLUOR धुंधला 37 पर किया जाता है डिग्री सेल्सियस और, इसलिए, पहले एंटीबॉडी धुंधला (बर्फ पर) एंटीबॉडी कैपिंग के लिए संभावित ° जो 37 में हो सकता है सी. रोकने के लिए पूरा होने की जरूरत चूंकि कोशिकाओं ALDEFLUOR अभिकर्मक तपका कर सकते हैं, यह महत्वपूर्ण है 4 बजे ALDEFLUOR बफर में कोशिकाओं को बनाए रखने ° सी ALDEFLUOR धुंधला के बाद पूरा हो गया है. ALDEFLUOR बफर एक दवा तपका अवरोध करनेवाला है कि ALDEFLUOR के intracellular स्तर को बनाए रखने में मदद करता है शामिल हैं.

चूंकि इस विधि व्यवहार्य अग्नाशय सीएससी आइसोलेट्स वे प्रयोगों है कि इन कोशिकाओं के शारीरिक समारोह को मापने का एक संख्या में लागू किया जा सकता है. हम ट्यूमर दीक्षा immunocompromised चूहों और में इन विट्रो सेल / प्रवास आक्रमण assays उपयोग assays के लिए इन कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है. इसके अलावा, शाही सेना डीएनए और प्रोटीन विश्लेषणात्मक सीएससी और गैर – सीएससी आबादी की तुलना अध्ययन के लिए इन कोशिकाओं से एकत्र किया जा सकता है.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM		Invitrogen (Carlsbad, CA)	11965-118
Fetal calf serum		Harlan (Indianapolis, IN)	BT-9501
Penicillin-streptomycin		Invitrogen	15140-122
Collagenase type IV		Invitrogen	17104-019
Dispase		Sigma (St. Louis, MO)	D4818
100 x 20 mm culture dish		BD Biosciences (San Jose, CA)	353003
70-μm filter		BD Biosciences	352350
50-mL conical tube		BD Biosciences	352070
Ficoll-Paque Plus		GE Healthcare (Upsala, Sweden)	17-1440
ALDEFLUOR reagent system		Stem Cell Technologies (Vancouver, BC, Canada)	01700
Trypan blue		Invitrogen	15250-061
12 x 75 mm polystyrene test tubes		BD Biosciences	352054
CD44-APC (clone G44-26)		BD Biosciences	559942
CD24-PE (clone ML5)		BD Biosciences	555428
Mouse CD31-biotin		BD Biosciences	553371
Mouse lineage-biotin		Miltenyi Biotec (Auburn, CA)	130-092-613
Mouse H-2Kd-biotin		BD Biosciences	553564
IgG2bκ-APC		BD Biosciences	555745
IgG2aκ-PE		BD Biosciences	555574
Streptavidin-PerCP protein		BD Biosciences	554064
Propidium iodide		Sigma	P4170
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps		BD Biosciences	352235