Provning Protozoacidal aktivitet Ligand-lytisk Peptider Mot Termite Protozoa Gut In vitro (Protozoa Kultur) och In vivo (Mikroinjektion i Termite hindgut)
Summary
Vi presenterar förfaranden för att påvisa att ligander binder till ytan membranet i protozoer cellulosa-smälta protozoer i tarmen av Formosan underjordiska termiter med fluorescerande mikroskopi och att ligander tillsammans med lytisk peptider dödar dessa<em> In vitro</em> (Anaerob protozoer kultur) och<em> In vivo</em> (Injektion i termit hindgut).
Abstract
Vi utvecklar en ny metod för att underjordiska termit kontroll som skulle leda till minskat beroende av användningen av kemiska bekämpningsmedel. Underjordiska termiter är beroende av protozoer i hindguts arbetstagare att effektivt smälta trä. Lytisk peptider har visat att döda en mängd encelliga djur parasiter (Mutwiri et al. 2000) och även protozoer i tarmen av Formosan underjordiska termit, Coptotermes formosanus (Husseneder och Collier 2009). Lytisk peptider är en del av ospecifika immunförsvaret hos eukaryoter, och förstöra membran av mikroorganismer (Leuschner och Hans 2004). De flesta lytisk peptider sannolikt inte kommer att skada högre eukaryoter, eftersom de inte påverkar den elektriskt neutrala kolesterol-innehållande cellmembran högre eukaryoter (Javadpour et al. 1996). Lytisk peptid åtgärder kan riktas till specifika celltyper genom tillsats av en ligand. Till exempel, rapporterade Hansel et al. (2007) att lytisk peptider konjugerat med membran cancer cell receptor ligander kan användas för att förstöra cellerna bröstcancer, medan lytisk peptider ensam eller konjugerat med icke-specifika peptider inte var effektiva. Lytisk peptider har också konjugerad till mänskliga hormoner som binder till receptorer på tumörceller för riktade förstörelse av prostata-och testikelcancer cancerceller (Leuschner och Hans 2004).
I denna artikel presenterar vi tekniker som används för att demonstrera protozoacidal aktiviteten hos en lytisk peptid (Hecate) kopplad till en heptapeptid ligand som binder till ytan membranet för protozoer från tarmen av Formosan underjordiska termit. Dessa tekniker innefattar utrotande av tarmen från termit arbetare, anaerob kultur tarmen protozoer (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni,
Spirotrichonympha leidyi), mikroskopiska bekräftelse på att liganden märkt med en fluorescerande färg binder till termit tarmen protozoer och andra viltlevande protozoer men inte bakterier eller tarmen vävnad. Vi visar också att samma liganden kopplad till en lytisk peptid effektivt dödar termit tarmen protozoer in vitro (protozoer kultur) och in vivo (mikroinjektion i hindgut för arbetstagare), men är mindre bacteriacidal än lytisk peptid ensam. Förlusten av protozoer leder till döden av termiter på mindre än två veckor.
I framtiden kommer vi ingenjör genetiskt mikroorganismer som kan överleva i termiter hindgut och sprids via en termit koloni som "trojanska hästar" för att uttrycka ligand-lytisk peptider som skulle döda protozoer i termiter tarmen och därefter döda termiter i kolonin . Ligand-lytisk peptider även vara användbar för utveckling av läkemedel mot protozo parasiter.
Protocol
Discussion
Ligand-lytisk peptider har med framgång använts för att effektivt rikta och förstöra cancerceller (Hans och Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). Utifrån detta koncept har vi utvecklat en heptapeptid ligand som binder till ytan av protozoer i tarmen av Formosan underjordiska termiter och kopplat den till en lytisk peptid med målet att förstöra dessa obligata cellulosa-smälta symbionter i tarmen av termiter att uppnå termit kontroll (Husseneder och Collier 2009).
Vi bekräf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Allison Richard, tidigare chef för LSU peptiden anläggning för fluorescerande ligand syntesen, den Interdisciplinaray Centrum för bioteknisk forskning, UF för ligand-lytisk peptidsyntes och Socolovsky Mikroskop anläggningen för att ge tillgång till fluorescens mikroskop. Finansiering gavs av SERDP undersökande utvecklingsprogram (SEED) av försvarsdepartementet, Department of Energy och Naturvårdsverket, bioteknik AgCenter tvärvetenskaplig grupp Program och delstaten Louisiana.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL-2 | ||
| EDANS | Novabiochem | |||
| Anaerobic glove box | Coy Laboratories, Inc. | Custom made | ||
| Intellus environmental controller | Percival | I36NL | ||
| PC-10 Glass micropipette puller | Narishige Scientific Instrument Lab | PC-10 | ||
| Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm) | Narishige Scientific Instrument Lab | GD-1 | ||
| Leitz micromanipulators | Vermont Optechs, Inc. | ACS01 | ||
| Microinjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 | ||
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0005 | ||
| LEICA fluorescence imaging system | Leica | DMRxA2 | ||
| LEICA dissecting scope | Leica | MZ16 | ||
| LEICA microscope | Leica | DMLB | ||
| Olympus dissecting scope | Olympus | SZ61 |
References
- Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. Conjugates of lytic peptides and LHRH or βCG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases. Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).
- Husseneder, C., Collier, R. E., Bourtzis, K., Miller, T. A. Paratransgenesis for termite control. Insect Symbiosis. 3, 361-376 (2009).
- Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites. Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).
- Husseneder, C., Grace, J. K. Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).
- Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity. J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).
- Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera). Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).
- Leuschner, C., Hansel, W. Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments. Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).
- Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads. J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).
- Trager, W. The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa. Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).
