Summary
角膜共焦显微镜是一种非侵入性的临床技术，可用于量化C纤维损伤与神经性的严重程度增加患者的诊断和分层。
Abstract
周围神经病变的准确定量是很重要的定义处于危险的患者，预期恶化，并评估新的治疗方法。常规方法评估神经功能缺损和电生理和定量感觉测试的量化功能的改变，检测神经病变。然而，最早的损害，出现细小纤维，但这些测试主要是评估大纤维功能障碍，表现出的再生和修复能力有限。只允许直接检查的无髓神经纤维的损伤和修复技术，电子显微镜和皮肤打孔活检腓肠神经活检。然而，无论是侵入性的程序和需要长时间的实验程序和相当的专业知识。角膜共焦显微镜是一种非侵入性的临床技术，它提供了角膜神经纤维在体内成像。我们已经证明了早期神经损伤，先于皮肤活检表皮内的神经纤维与神经性的严重程度和修复以下胰腺移植对糖尿病患者分层损失。我们也证明了在特发性小纤维神经病变和法布里病的神经损害。
Protocol
简介：
周围神经病变的准确定量是很重要的定义处于危险的患者，预期恶化，并评估新的治疗方法。常规方法评估神经功能缺损和电生理和定量感觉测试的量化功能的改变，检测神经病变。然而，最早的损害，出现细小纤维，但这些测试主要是评估大纤维功能障碍，表现出的再生和修复能力有限。只允许直接检查的无髓神经纤维的损伤和修复技术，电子显微镜和皮肤打孔活检腓肠神经活检。然而，无论是侵入性的程序和需要长时间的实验程序和相当的专业知识。角膜共焦显微镜是一种非侵入性的临床技术，它提供了角膜神经纤维在体内成像。
HRT的III -罗斯托克角膜模块（RCM）
操作手册
1。相机的制备
在考试的最初步骤，使用HRT的物镜尖的准备。
- 首先，在激光扫描相机的客观管，设置12屈光度的折射，然后相机调整到最低位置。
- 套用一个大的同质性，泡沫自由，豌豆大小，镜头上的尖端，涉及的下降。
- 从无菌容器中取出一个TomoCap，它安装在镜头一角，凝胶，形成了一个半月板之间的物镜和第。尽可能在持有人可能推。小心不要触摸TomoCap前表面在安装过程中。
图1。物镜尖（顶）申请viscotear凝胶（底部）应用TomoCap准备。 - 移动激光扫描相机尽量向后摄像机安装可能。
- TomoCap的内外表面都出现一个明亮的激光反射。应调整焦平面调整轮，直到光明的反映，是观察，表明该镜头集中在前面的第的。在重点位置显示显示深度值现在应该-150微米，150微米之间。
- 将深度设置重置为零。
图2。焦平面调整。
2。准备病人
拍摄主体的眼睛是麻醉使用下降0.4％benoxinate盐酸，“活视康”人造眼泪水润滑眼睛的前面。
坐在舒适的主题是，与下巴的下巴上休息，并要求坚决按他们的额头对额头栏。
图3准备病人。
3。对齐相机
它使考试更容易，如果您指示病人与没有被检查眼外固定光修复。显微镜头小巧的尺寸意味着主体的对侧眼不遮挡，使使用距离目标。
图4。角膜模块的物镜。
- CCD相机等，其光轴垂直的激光扫描摄像机的光轴的位置。相机应该对病人的右侧时，成像的右眼，反之亦然。
在这个位置上，你应该看到TomoCap前表面的CCD相机实时图像的中心。 - 移动的激光扫描对病人的相机，直到病人的角膜在一个约5至10毫米的TomoCap距离是移动的激光扫描相机上/下和左/右使用摄像机安装上的黑色旋钮，直至在TomoCap是在患者的角膜的中心位置。在这个阶段，您可以检查红色激光灯是在角膜中心和微调，观察角膜，这是在CCD摄像机的图像中可见的激光束的反射。这种反思必须完全发生在角膜前极。
图5。对准捕捉角膜中央图像角膜的前极的激光束。 - 让患者尽可能广泛的他/她的眼睛打开。慢慢地向前移动的激光扫描相机对病人直到TomoCap接触病人的角膜。如果它是必需正确的激光扫描摄像机的位置，然后移动相机远离病人第一，做了校正，然后将它再次接触角膜。
图6。TomoCap和角膜之间的薄露桥的示范。 - 相机和角膜之间的最小的接触是不够的。在优化调整，薄露TomoCap和角膜之间的桥梁上的CCD相机实时图像是可见的。
如果按TomoCap或移动相机太接近角膜，然后你会看到一个通过CCD相机实时图像的外观扁平角膜在角膜上的压力。也得到了线的图像显示会出现的压力，因此并不适用于角膜的压力太大。一旦接触已经建立，不要移动headrestto避免角膜上TomoCap滑动的位置。
图7（左）一个straie由于对角膜的TomoCap压力过大应用程序的外观;（右）与正常的外观没有多余的压力形象。
4。检查病人
视野已被选定后，被打开的HRT III激光相机和图像采集窗口出现在屏幕上。使用CCD图像TomoCap和对病人的角膜激光灯的位置。然后可以开始使用所选择的模式的考试。
图8。查看监视器上的图像采集过程中的模式。
采集模式
在部分模式中，一个单一的形象收购和储存您每次按下脚踏开关。我们使用这种模式下，捕获图像从整个角膜层包括鲍曼的一层角膜中心。然后捕获足够数量的图像后，可以尝试其他模式，包括顺序和数量。
图9显示不同的图像采集方式与选择。
与序列扫描，可以获取一个可调节的帧速率高达100张图像的序列。您可以选择之间的帧速率30帧和1帧每秒（fps）和基于这种模式，它可以让你获得为期3至100秒的影片。
在容积扫描模式下，相机会自动获得一个系列40个连续的焦平面图像。一个85微米的总深度，可以扫描“视野400微米”场镜和连续两个图像之间的焦距，将约2.1微米。
经过几次扫描镜头聚焦平面是可以改变的，相对的角膜上皮细胞层，将成为关注的焦点，然后按一下复位按钮深度值设置为0表面的角膜细胞层的深度来衡量的。
对于我们目前研究的目的，我们得到从不同深度的角膜中央的图像。因此，我们不走动角膜激光扫描相机的水平或垂直的，我们只是向前或向后移动，并捕获在同一角膜点鲍曼的层深处的图像。每幅图像之间的距离大约是1微米，因此，如果鲍曼的深度为10μm，我们将有10张。然而，归根结底，我们选择约2-3微米它们之间的距离的图像。
检查后完成收购窗口中按一下相机的电源按钮关闭相机。使病人意识到，他或她不应该擦他或她的眼睛，直到局部麻醉消失。作为一项预防措施，你不妨在考试后执行一个病人的角膜裂隙灯检查。
从相机中取出TomoCap，处理它，然后用棉花清洁显微镜镜头棉签蘸蒸馏水。
5。考试分析
A.选择帧
审查和分析现有的考试，选择合适的病人记录（S）必须在数据库窗口。图像浏览窗口，提供了一个现有的角膜检查概述选定的病人。在不同的日子进行的考试都存储在单独的访问选项卡。三种不同的扫描类型，代表三种不同的图标，在HRT三角膜访问“选项卡，喜的图像浏览窗口delberg眼科资源管理器。
调查角膜图像，单击相应的图像图标和“显示”功能打开下面的窗口：
图10显示拍摄的图像后，检查所有。
图11出口前眼与CCD相机视图显示正确对齐选定的图像显示。
要导出相应的图像作进一步的分析，点击工具栏上的“导出”，然后选择你要保存的图像文件夹。
我们获取和为每一个病人的角膜层捕获的图像，但这项研究的主要焦点是鲍曼的层和角膜神经，只有这一层的图像进行分析。我们选择从鲍曼的每个科目在不同深度的角膜层5-6帧。
图12显示，从一个健康的主题所有角膜层。
在鲍曼的角膜中心层在不同深度的平均5-6帧是随机选取的定量测量和分析。
B.分析图像
鲍曼的角膜中央与HRT的第三层，从拍摄的图像进行分析，我们使用专门的软件称为“CCM的图像分析工具v 0.6”本集团内已开发的。
角膜神经的四个主要参数的测量，用这个软件：
- 神经纤维密度（NFD），这是定义为主要神经/帧的数量。
- 神经分支密度（NBD）的主要分支/帧。
- 神经纤维长度（NFL），这是所有神经/帧的总长度。
- 神经纤维迂曲（NFT）的主要神经/帧。
要打开CCM的形象，去文件>打开。
- 一旦加载图像，其大小和类型显示在控制面板的左上角手端的图像信息框。
- 默认的规模是显示在编辑行的图像信息。如果规模是不同的，修改在编辑行的数量。
- 要开始分析的图像，选择你想测量从在控制面板的右上角方公制中的参数。
- 在结果框在页面的NFD的底部，NBD的实际数量，NFL作为一个曲折系数（TC）毫米和迂曲。
- 然而，之后的结果导出到Excel工作表，结果将没有/ NFD的NBD和毫米/ 毫米 2为NFL 2毫米。
- 为此，整理后的测量点击添加测量，然后转到文件>另存为，然后用Excel打开保存的结果。
图13。角膜神经图像显示与跟踪分析工具使用“CCM图像分析工具”。
6。代表性的成果：
我们已经证明了一个渐进的角膜神经变性日益增加1和糖尿病神经病变在糖尿病早期神经损伤，先在皮肤活检表皮内神经纤维的损失 2 以下 3胰腺移植对糖尿病患者神经性的严重程度和修复分层的严重性。我们也证明了神经损伤特发性小纤维神经病4 Fabry病5。
图14。HRT的角膜鲍曼的第三层（一）控制主体（b）与神经病变和严重的神经损伤患者相比角膜共聚焦显微镜图像。
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Discussion
角膜共聚焦显微镜（CCM）是一种无创的临床技术，可用于检测早期神经损伤小纤维病变和周围神经病变，包括糖尿病，Fabry病和特发性小纤维神经病（ISFN）量化。眼前的这个技术的临床影响，在我们的能力诊断，后续的进展和评估糖尿病的神经病变和其他周围神经病变患者的治疗反应和患者的治疗效果将有一个直接的影响方面的一个巨大的飞跃。
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Disclosures
图4 - 6：海德堡工程礼貌
Acknowledgments
这项工作是支持青少年糖尿病研究基金会国际（批17-2008-1031）和美国国立卫生研究院（授予1R01DK077903 - 01A1）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HRT III CCM Machine - The Rostock Cornea Module | Heidelberg Engineering | ||
| CCM image analysis software v0.6 | University of Manchester |
References
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