Summary
각막 공촛점 현미경은 증가 neuropathic 심각 환자를 진단하고 계충화하다하는 C 섬유 손상을 계량하는 데 사용할 수있는 비침습 임상 기술입니다.
Abstract
주변 신경 장해의 정확한 양을 정함은 위험 환자에서 정의 악화를 예상하고, 새로운 치료를 평가하는 것이 중요합니다. 종래의 방법은 신경 결손 및 전기 생리학을 평가하고 정량 감각 테스트는 신경 장해를 감지하는 기능 변경을 단정. 그러나, 최초의 손상이 작은 섬유로하고 아직 이러한 검사가 주로 대형 섬유 장애를 평가하고 재생과 수리를 입증하기 위해 제한된 능력을 가지고 나타납니다. unmyelinated 신경 섬유 손상 및 수리를 직접 시험을 허용하는 유일한 기술은 sural 신경은 전자 현미경 및 피부 펀치 생검과 생검 있습니다. 그러나, 모두 침략 절차이며 긴 실험실 절차와 상당한 전문 지식을 필요로합니다. 각막 공촛점 현미경이 각막 신경 섬유에서 - 생체내 이미징을 제공하는 비침습 임상 기술입니다. 우리는 neuropathic 심각하고 당뇨병 환자 수리 다음 췌장 이식의 충화과 함께 피부 biopsies에서 intraepidermal 신경 섬유의 손실을 앞에 초기 신경 손상을 증명하고있다. 우리는 또한 특발성 작은 섬유 신경 장해 및 파브리의 질병에있는 신경 손상을 증명하고있다.
Protocol
소개 :
주변 신경 장해의 정확한 양을 정함은 위험 환자에서 정의 악화를 예상하고, 새로운 치료를 평가하는 것이 중요합니다. 종래의 방법은 신경 결손 및 전기 생리학을 평가하고 정량 감각 테스트는 신경 장해를 감지하는 기능 변경을 단정. 그러나, 최초의 손상이 작은 섬유로하고 아직 이러한 검사가 주로 대형 섬유 장애를 평가하고 재생과 수리를 입증하기 위해 제한된 능력을 가지고 나타납니다. unmyelinated 신경 섬유 손상 및 수리를 직접 시험을 허용하는 유일한 기술은 sural 신경은 전자 현미경 및 피부 펀치 생검과 생검 있습니다. 그러나, 모두 침략 절차이며 긴 실험실 절차와 상당한 전문 지식을 필요로합니다. 각막 공촛점 현미경이 각막 신경 섬유에서 - 생체내 이미징을 제공하는 비침습 임상 기술입니다.
HRT III - 로스 토크 각막 모듈 (RCM)
작동 매뉴얼
1. 카메라 준비
HRT를 사용하여 시험의 초기 단계는 객관적인 렌즈 팁의 준비입니다.
- 먼저 레이저 스캔 카메라의 객관적인 튜브에서 12 디옵터로 굴절을 설정하고 가장 낮은 위치로 카메라를 조정합니다.
- 무료로 큰 동질적인, 거품, 렌즈 끝에 Viscotears의 크기 완두콩 드롭을 적용합니다.
- 는 무균 컨테이너에서 TomoCap를 제거하고 젤 목적 렌즈와 뚜껑 사이에 초승달 모양을 형성 이러한 렌즈 팁을 통해 그것을 탑재합니다. 까지 홀더를 통해 가능한 한 그것을 밀어. 설치하는 동안 TomoCap의 전면 표면을 만지지 않도록주의하십시오.
그림 1. TomoCap 적용 viscotear 젤 (아래) 적용 대상이 렌즈 팁 (상단)의 준비. - 멀리 뒤로 가능한 카메라 마운트에있는 레이저 스캔 카메라를 이동합니다.
- TomoCap의 내부와 외부 표면은 모두 밝은 레이저 반사으로 나타납니다. 밝은 반사는 렌즈 뚜껑의 전면 이내에 초점을 맞춘 것을 나타냅니다 관찰 때까지 초점 비행기 조정 휠을 조정해야합니다. 초점 위치 표시에 표시되는 깊이 값이 이제 -150 μm의와 150 μm의 사이에 있어야합니다.
- 0으로 깊이 설정을 재설정합니다.
그림 2. 초점 비행기의 조정.
2. 환자를 준비
주제의 눈은 0.4 % benoxinate 염산염의 드롭을 사용하여 anesthetized 있으며, Viscotears는 윤활에 대한 눈의 전면에 사용됩니다.
제목은 친 나머지에 턱과 함께 편안하게 앉아 있고 이마 표시줄에 대해 단호하게 자신의 이마를 눌러 요청합니다.
그림 3. 환자를 준비
3. 카메라를 정렬
당신은 환자가 검사되지 않는 눈으로 외부 고정 불 수정을 지시하는 경우는 시험이 쉬워집니다. 현미경 헤드의 컴팩트한 크기는 거리에 대상의 사용을 가능하게 피사체의 contralateral 눈이 분명하지 않다는 것을 의미합니다.
그림 4. 각막 모듈의 목적 렌즈.
- 의 광축은 레이저 스캔 카메라의 광축에 직각으로 실행 같은 CCD 카메라를 위치. 카메라는 환자의 오른쪽에 있어야 할 때 영상의 오른쪽 안구와 그 반대합니다.
이 위치에, 당신은 CCD 카메라 라이브 이미지의 중심에 TomoCap의 전면 표면을 볼 수 있습니다. - 환자의 각막이 TomoCap 10-5 약 mm의 거리에서까지 환자 향해 레이저 스캔 카메라를 이동 TomoCap 때까지 위 / 아래 레이저 스캔 카메라를 이동하고 왼쪽 / 오른쪽으로 카메라 장착에 검은 손잡이를 사용하여 환자의 각막의 중앙에 위치합니다. 이 단계에서 당신은 붉은 레이저 빛이 각막의 중앙에 있는지 확인하고 미세한 조절을 위해, CCD 카메라 이미지에서 볼 수있는 각막에서 레이저 광선의 반사를 관찰합니다. 이 반사는 각막의 앞쪽에 극에서 정확하게 발생합니다.
그림 5. 중앙 각막 이미지를 캡처하는 각막의 앞쪽에 극에 레이저 빔을의 정렬. - 가능한 넓은으로 그 / 그녀의 눈을 열 환자를 요청합니다. 환자 TomoCap 연락처 때까지 환자의 각막쪽으로 천천히 전달 레이저 스캔 카메라를 이동합니다. 그것은 필요한 경우레이저 스캔 카메라의 위치를 수정하려면 다음 다음 각막 연락을 다시 앞으로 움직여, 정정을, 멀리 떨어진 환자에서 처음으로 카메라를 이동합니다.
그림 6. TomoCap와 각막 사이의 얇은 젤 다리의 데모. - 카메라와 각막 사이에 거의 접촉이 충분하다. 최적의 조정에서, TomoCap와 각막 사이에 얇은 젤 다리는 CCD 카메라 라이브 이미지를 볼 수 있습니다.
당신이 카메라에 너무 가까이 각막을 TomoCap 누르거나 이동면 당신은 CCD 카메라 라이브 영상을 통해 각막의 평평 모양으로 각막에 대한 압박을 볼 수 있습니다. 또한 이미지에 따라서 각막에 너무 많은 압력을 적용하지 압력이 나타납니다 보여주는 라인을 획득하였습니다. 일단 연락이 설립되었습니다, headrestto이 TomoCap에 각막 미끄럼 방지의 위치를 이동하지 않습니다.
그림 7 (왼쪽) TomoCap에 의해 각막에 과도한 압력을 응용 프로그램으로 인해 straie의 외관,. 과도한 부담없이 정상적인 모습 (오른쪽) 이미지.
4. 환자를 검토
보기의 필드가 선택되고 나면, HRT III 레이저 카메라가 켜져 있고 이미지 수집 창이 화면에 나타납니다. 환자의 각막에 TomoCap과 레이저 빛을 위치에 CCD 이미지를 사용합니다. 선택 모드를 사용하여 시험 다음 시작 수 있습니다.
그림 8. 이미지를 취득하는 동안 모니터 모드를보기.
취득 모드
섹션 모드에서는 하나의 이미지가 당신이 발 스위치를 누를 때마다 시간을 획득하고 저장됩니다. 우리는 각막의 중앙에 보먼의 레이어를 포함한 전체 각막 레이어에서 이미지를 캡처에 대해이 모드를 사용합니다. 그리고 이미지의 충분한 숫자를 캡처 후, 하나는 시퀀스와 볼륨을 포함하여 다른 모드를 시도해 볼 수 있습니다.
그림 9. 다른 이미지 수집 모드 선택 표시합니다.
순서 검사로, 하나는 조절 프레임 속도와 최대 100 이미지의 순서를 수집할 수 있습니다. 당신은 30 프레임, 1 초당 프레임 (FPS)과 그것이 당신이 3~1백초의 기간과 함께 영화를 수집할 수 있도록이 모드에 따라 사이의 프레임 속도를 선택할 수 있습니다.
볼륨 스캔 모드에서 카메라가 자동으로 연속 초점 비행기 40 이미지의 시리즈를 얻습니다. 85 μm의 총 깊이는 약 2.1 μm의 것입니다 "FOV 400 μm의"필드 렌즈와 연속 2 이미지 사이의 초점 거리와 스캔 수 있습니다.
몇 가지 검사 후 렌즈의 초점 비행기가 초점으로 상피 세포의 레이어를 데려오 후 0으로 깊이 값을 설정 재설정 버튼을 클릭하여 각막 표면에 상대적으로 각막 세포 층의 깊이를 측정하기 위해 변경할 수 있습니다.
우리의 현재 연구의 목적을 위해, 우리는 다른 깊이에있는 중앙 각막의 이미지를 구하십시오. 그러므로 우리가 가로 또는 세로 각막 주위의 스캔 레이저 카메라를 움직이지 마세요, 우리는 뒤로 앞으로 이동하고 같은 각막 시점에서 보먼의 레이어의 모든 깊이의 이미지를 캡처합니다. 각 이미지 사이의 거리는 약 1 μm의이며 보먼의 깊이는 10 μm의 경우 따라서, 우리는 10 이미지를합니다. 그러나 최종 분석을 위해, 우리는 그들 사이에 약 2-3 μm의의 거리 이미지를 선택합니다.
시험 후 취득 윈도우에서 카메라의 전원 버튼을 클릭하여 카메라를 해제 완료됩니다. 국소 마취가 없어진 때까지 그 또는 그녀가 자신의 눈을 비벼해서는 안되는 환자가 인식합니다. 예방 차원에서, 당신은 시험 후 환자의 각막의 슬릿 램프 시험을 수행하실 수 있습니다.
카메라에서 TomoCap를 제거하고 폐기 후 면봉으로 현미경의 렌즈를 청소 면봉은 증류수와 moistened.
5. 시험 분석
A. 프레임을 선택
기존의 시험을 검토하고 분석하기 위해, 적절한 환자 기록 (들)은 데이터베이스 창에서 선택해야합니다. 이미지보기 창이 선택된 환자에 대한 기존의 각막 시험의 개요를 제공합니다. 다른 요일에 실시 시험은 별도의 방문 탭에 저장됩니다. 세 가지 검사 유형은 헤리의 이미지보기 윈도우의 HRT III의 각막 방문 탭에서 다음 세 가지 아이콘으로 표시됩니다delberg 아이 Explorer를 종료합니다.
각막 이미지를 조사하려면 해당 이미지 아이콘을 두 번 클릭하고 "보기"기능은 다음과 창이 열립니다 :
그림 10. 시험 후 모든 촬영된 이미지의 표시합니다.
그림 11. 올바른 정렬을 보여 안구의 CCD 카메라보기로 수출하기 전에 선택한 이미지의 표시합니다.
자세한 분석을 위해 적절한 이미지를 내보내려면, 도구 모음에서 "내보내기"를 클릭하고 다음에 이미지를 저장할 폴더를 선택합니다.
우리가 해낼수 각 환자에 대한 각막의 모든 레이어에서 이미지를 캡처하지만, 본 연구의 주요 초점으로 보먼의 레이어와 각막 신경에,이 레이어에서 단 이미지 분석됩니다. 우리는 각막의 여러 깊이에서 각 과목에 대한 보먼의 레이어 5-6 프레임을 선택합니다.
그림 12. 건강한 주제에서 모든 각막 레이어의 표시합니다.
평균적으로 다른 깊이에서 각막의 중심에 보먼의 레이어 5-6 프레임은 정량 측정 및 분석을 위해 무작위로 선택됩니다.
B. 이미지 분석
HRT III와 중앙 각막의 보먼의 계층에서 캡쳐한 이미지를 분석, 우리는 "CCM 이미지 분석 도구 V 0.6"이라는 우리의 그룹 내에서 개발되었습니다 전문 소프트웨어를 사용합니다.
각막 신경을 위해 네 가지 주요 매개 변수는이 소프트웨어와 측정 :
- 주요 신경 / 프레임의 숫자로 정의됩니다 신경 섬유 밀도 (NFD).
- 주요 지점 / 프레임의 신경 지점 밀도 (NBD) 번호입니다.
- 신경 섬유 길이 (NFL) 모든 신경 / 프레임의 총 길이이기도합니다.
- 주요 신경 / 프레임의 신경 섬유 꼬부라짐 (노퍽 표준시).
CCM 이미지를 열려면, 파일을 이동> 엽니다.
- 이미지가로드되면, 그 크기와 타입은 제어판의 상단 왼쪽 사이드에있는 이미지 정보 상자에 표시됩니다.
- 기본 크기는 이미지 정보의 편집 라인에 표시됩니다. 규모가 다른 경우, 편집 라인의 번호를 수정합니다.
- 이미지를 분석 시작하려면, 당신이 제어 패널의 오른쪽 상단에있는 메트릭 상자에서 측정하고자하는 매개 변수를 선택합니다.
- 페이지 NFD의 개수의 하단에있는 결과 상자에서, NBD는 꼬부라짐 계수 (TC)로 mm와 꼬부라짐 실제 번호, NFL (전미 풋볼 리그)에서 제공됩니다.
- 그러나 엑셀 시트에 그 결과를 수출 후, 그 결과는 NFD와 NBD 및 MM / NFL에 대한 mm 2 노 / mm 2가 나타납니다.
- 이러한 목적으로 측정 추가 측정 클릭 마치고, 다음 파일 이동> Excel에서 저장된 결과를 열려면 다음 다른 이름으로 저장합니다.
그림 13. "CCM 이미지 분석 도구"를 사용하는 분석 도구의 추적과 각막 신경 이미지 표시합니다.
6. 대표 결과 :
우리는 보여준 프로 그레시브 당뇨병 신경 장해 1 당뇨병 환자의 췌장 이식 3 다음 neuropathic 심각하고 복구의 충화과 함께이 피부 biopsies에서 intraepidermal 신경 섬유의 손실을 앞에 당뇨병 초기에 신경 손상의 증가 심각와 각막 신경 변성 증가.을 우리는 또한 특발성 작은 섬유 신경 장해 4 파브리 질환 5 신경 손상을 증명하고있다.
그림 14. 각막 보먼의 레이어의 HRT III 신경 장해와 신경 계통에 치명적인 손상과 (B) 환자에 비해 (A) 제어 제목 각막 공촛점 현미경 이미지.
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Discussion
각막 공촛점 현미경 (CCM)은 초기 신경 손상을 감지하고 당뇨병, 파브리 질환과 특발성 작은 섬유 neuropathies (ISFN)를 포함한 주변 neuropathies의 작은 섬유 병리학을 계량하는 데 사용할 수있는 비침 투 임상 기법입니다. 이 기법의 즉각적인 임상 영향은 진단, 진행에 따라 평가 당뇨병 신경 장해 및 기타 주변 neuropathies 환자의 치료 반응과 환자 결과에 즉각적인 영향을 미칠 것입니다 우리의 능력의 관점에서 앞으로 큰 도약을 나타냅니다.
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Disclosures
그림 4-6 : 하이 델베르크 공학 커터
Acknowledgments
이 작품은 소아 당뇨병 연구 재단 국제 (부여 17-2008-1031)과 국립 보건원 (부여 1R01DK077903 - 01A1)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HRT III CCM Machine - The Rostock Cornea Module | Heidelberg Engineering | ||
| CCM image analysis software v0.6 | University of Manchester |
References
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