Vi har utvecklat en Lentiviral vektor som har, utöver de Tat-lyhörd LTR, REV-respons element (RRE) som kan reglera uttrycket reporter genen i en HIV-1 Tat-och Rev-beroende sätt. Vektorn medger detektering av replikera hiv i levande celler genom uttryck av GFP.
De flesta av HIV-lyhörd expressionsvektorer är baserade på hiv-promotorn, den långa terminala repetera (LTR). Medan lyhörda för en tidig HIV-protein, Tat, är LTR också lyhörd för cellulär aktivering stater och till den lokala kromatin aktivitet där integrationen har inträffat. Detta kan resultera i hög hiv-oberoende aktivitet, och har begränsat nyttan av LTR-baserad reporter för att markera hiv-positiva celler 1,2,3. Här byggde vi ett uttryck Lentiviral vektor som har, utöver de Tat-lyhörd LTR, många HIV-DNA-sekvenser som innehåller Rev-respons element och hiv webbplatser skarvning 4,5,6. Vektorn införlivades en Lentiviral reporter virus, vilket möjliggör mycket specifika upptäcka replikera hiv i levande cell populationer. Aktiviteten av vektorn mättes med uttryck av grön fluorescens protein (GFP). Tillämpningen av denna vektor som rapporterats här erbjuder ett nytt alternativ till befintliga metoder, till exempel in situ PCR-eller HIV-antigen färgning, för att identifiera hiv-positiva celler. Vektorn kan också uttrycka terapeutiska gener för grundläggande och kliniska försök att rikta hiv-positiva celler.
Som med de tidigare utvecklade Tat-beroende expressionsvektorer beskrev varven systemet här är ett utnyttjande av ett utvecklat HIV-process. Införandet av Rev-beroende gör LTR-baserade uttryck vektor starkt beroende av förekomsten av replikera hiv. Tillämpningen av denna vektor som rapporterats här, en HIV-beroende reporter virus, erbjuder en ny ny metod för att identifiera hiv-positiva celler. Vektorn tillåter granskning av levande celler kan uttrycka någon gen för grundläggande eller kliniska försök, och som en pseudo-skrivit lentivirus har tillgång till de flesta celltyper och vävnader.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöddes delvis av Public Health Service bevilja 1R01AI081568 från NIAID till YW och genom generösa donationer från donatorer och ryttare i 2009 NYCDC aids Ride organiseras av M. Rosen och Dag2 Inc.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Biosafety Cabinet | ||||
37°C 5%CO2 incubator | ||||
Flow cytometer | FACSCalibur | |||
Centrifuge | Beckman | Allega™6KR | ||
4°C regrigerator | ||||
-20°C refrigerator | ||||
-80°C refrigerator | ||||
Cell counter | Nexcelom | Cellometer™ AutoT4 | ||
HEK293T cell line | NIH | |||
CEM-SS cell line | NIH | |||
Jurkat cell line J1.1 | NIH | |||
DMEM | Invitrogen | 11965-118 | ||
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | ||
HI FBS | Invitrogen | 10438-018 | ||
HIV-1NL4-3 | prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA | |||
pNL-GFP-RRE | copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3 | |||
pNL-GFP-RRE-SA | Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE | |||
pCMVΔ8.2 | provided by Dr. Dider Trono | |||
pHCMV-G | ||||
10 x HBS (Hepes Buffered Saline) | Invitrogen | 11344-041 | ||
2M CaCl2 buffer | Invitrogen | S-013-154-10 | ||
1% paraformaldehy | Sigma Aldrich | 158127 | ||
Bleach | ||||
50ml Falcon tubes | BD Bioscience | 358206 | ||
5ml round bottom tubes | BD Bioscience | 352063 | ||
0.45μM Millipore filter | Millipore | SLHA033SS | ||
0.20μM Millipore filter | Millipore | SLFG85000 | ||
100mm Petri-dish | Sigma Aldrich | CLS430588 | ||
Size-exclusion column (100,000MW cut off) | SartoriuStedim biotech | VS2041 | ||
2ml frozen tube | Axygen | SCT-200 | ||
96-well plate | BD Bioscience | 353227 | ||
1.7mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT- 175-C |