Summary
Kennis van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen smaak transductie heeft onlangs genoten van belangrijke vooruitgang, vooral door het gebruik van dierlijke modellen. Echter, de grote verscheidenheid in smaak sensitiviteit en specificiteit bij zoogdieren garandeert studies in menselijk weefsel. Beschrijven we een biopsie techniek om levende cellen te verzamelen smaak van de papillen op de menselijke tong.
Abstract
Het gevoel van smaak is van cruciaal belang voor het menselijk leven. Het informeert de instelling over de kwaliteit van voedsel dat mogelijk zal worden ingenomen en stimuleert de metabolische processen die het spijsverteringskanaal te bereiden voor de spijsvertering. Gestage vooruitgang wordt geboekt bij het begrijpen van de vroege biochemische en moleculaire gebeurtenissen die ten grondslag liggen smaak transductie (voor een overzicht, Breslin en Spector, 2008 1). Er is echter tot dusver geboekte vooruitgang vooral te danken aan diermodellen. Toch, omdat grote verschillen in de receptor specificiteit en receptor dichtheid varieert van soort tot soort, zullen de menselijke smaak transductie alleen begrepen worden door gebruik te maken menselijke smaak weefsel. Hier beschrijven we een biopsie techniek om menselijke fungiform papillen, zichtbaar als ronde roze voorste structuren, het verzamelen van ongeveer 0,5 mm in diameter die smaakpapillen bevatten. Deze biopsie papillen worden gebruikt voor diverse doeleinden, waaronder het isoleren van levensvatbare smaakknop cellen, in situ hybridisatie, immunohistochemie en, door middel van technieken van de moleculaire biologie, de identificatie van de smaak-specifieke nieuwe eiwitten.
Protocol
1. Inleiding en algemene overwegingen
De algemene procedure heeft betrekking op plaatselijke verdoving van een klein (1 cm 2) deel van het dorsale oppervlak van de voorste tong, gevolgd door verwijdering van een aantal (6-8) van fungiform (smaak) papillen uit dat verdoofd gebied met behulp van een gebogen veer micro -schaar (McPherson-Vannas het type # SR 5603, Roboz, Rockville, MD). De verwijderde fungiform papillen zijn ongeveer 0,25 mm 3 per stuk. Er is zeer weinig niet-papillen (smaak) epitheelweefsel verwijderd, samen met elke papil. Nieuwe papillen vormen op dit gebied na 3 tot 5 weken en weer functioneren smaakpapillen (Spielman en Brand, ongepubliceerde waarnemingen). Er is geen merkbaar effect op de smaak of geur van voedsel na het verwijderen van deze kleine hoeveelheid van smaak materiaal. Uit studies dat individuele smaakpapillen hebben geteld in het volwassen menselijke tong, kan worden geschat dat de menselijke tong ongeveer 5000 smaakpapillen bevat. Onze procedure wordt maximaal 20 tot 25 van deze smaakpapillen (gemiddeld, ~ 3,5 tot 4 smaakpapillen per fungiform papil in de menselijke) 2, of ongeveer 0,4% van het totaal. Daarnaast is er geen pijn geassocieerd met de chirurgische verlies van dit weefsel. Men voelt zich, uiteraard, lichte pijn op de injectieplaats alleen, zoals de naald de tong. Na de verdoving is uitgewerkt, er is af en toe licht ongemak voor minder dan een dag, maar dit ongemak is veel minder dan wat een ervaringen na per ongeluk "bijten" degenen tong.
In de afgelopen jaren hebben wij een alternatieve procedure die niet is opgenomen anesthesie. De techniek voor het verwijderen van weefsel is identiek voor beide. Het enige verschil in de procedure is dat de chirurg is niet langer beperkt tot een 1 cm 2 doorsnede gebied waar de verdoving was gericht. In plaats van hij / zij kan kiezen voor een site op het dorsale oppervlak van de tong, waar prominente papillen verschijnen. Het totale aantal verwijderde papillen zijn beperkt tot 6-8 in beide technieken, met of zonder verdoving Als dit goed wordt uitgevoerd, is het ongemak van het verwijderen van 6-8 fungiform smaak papillen als minder van een probleem in vergelijking met de pijn geassocieerd met het toedienen van lokale anesthesie Een algemeen overzicht van de personen die ondergingen beide procedures, dat wil zeggen, met en zonder verdoving, toonde aan dat een overgrote meerderheid van de proefpersonen zou afzien zonder lokale anesthesie in alle toekomstige biopsies. De chirurg die deze techniek ontwikkelde (AIS) en een aantal collega's gegeven door de auteur die biopsieën uitgevoerd zonder verdoving, hebben geprobeerd het op zichzelf en getuigen dat het ongemak tijdelijk is en wordt beschouwd als minder dan die van tong bijten je. Ten slotte werden tientallen personen die overeengekomen is biopsie gevraagd of ze bereid zou zijn om het verwijderen van een papilla te proberen zonder verdoving en als zij oordelen dat het te pijnlijk zouden ze narcose ondergaan, hebben alle toegezegd dat met het verwijderen van de papillen voort te zetten zonder anesthesie.
De hele biopsie mag niet langer duren dan 5-10 minuten. Als anesthesie wordt gebruikt nog 2-3 minuten wordt toegevoegd. Biopsie wordt meestal uitgevoerd in de ochtenduren. Voor biopsie, zijn vrijwilligers geïnstrueerd om een lichte maaltijd te eten twee uur voor de geplande starttijd. Bij biopsie, is geschreven informed consent verkregen. Uitsluitingscriteria ten tijde van de biopsie omvatten die met een ernstige chronische ziekte, of door medicatie of niet (bijvoorbeeld, een gastro-intestinale ziekten, neurodegeneratieve ziekten, kanker, bloeddyscrasieën, allergie voor de plaatselijke verdoving, enz.) die met een hartslag van meer dan 100 of minder dan 60; systolische bloeddruk hoger dan 145 of minder dan 100; diastolische bloeddruk hoger dan 90 of minder dan 60, en het advies van de chirurg die het onderwerp kan deelnemen aan het onderzoek.
Tot slot is het belangrijk om van mening dat de biopsie procedure moet worden uitgevoerd in dezelfde faciliteit waar weefsel zal worden verwerkt voor het onderzoek, omdat weefsel integriteit wordt snel verloren we vaak opgemerkt door de afnemende kwaliteit van het mRNA. Te minimaliseren deze problemen de tong weefsel moet zo snel mogelijk worden verwerkt.
2. Onderwerp Voorbereiding
- Het onderwerp zit in een tandartsstoel of een stoel met een hoofdsteun.
- Controleer de hartslag en de bloeddruk op het moment van de biopsie. Moet het onderwerp vallen buiten het bereik van de bloeddruk, hartslag of mondeling competentie, de chirurg adviseert om het onderwerp dat hij / zij direct afspraak te maken naar een arts te zien.
- Inspecteer de mondholte voor de algemene gezondheid van weefsel, met aandacht voor de indicatoren van xerostomie, geografische tong of de tong laesies. Elk onderwerp tekenen van orale ziekten, met inbegrip van de tong laesies of xerostomie zijn uitgesloten van de studie. Instrueer het onderwerp naar de mond te spoelen met water om alle vuil te verwijderen van de orale Cavity. Indien nodig de tong wordt gereinigd met een wegwerp tong scrapper om plaque of vuil te verwijderen, die kunnen in de tong worden uitgevoerd tijdens de injectie van de anesthesie. De chirurg maakt gebruik van steriele gaasjes in een gehandschoende hand om de voorste ¼ van de tong te houden als het strekt zich uit van de mondholte.
- Als anesthesie wordt gebruikt, een 1cc tuberculine spuit met een 28 gauge x ½ 'naald met 0,25 ml lidocaïne (2%) met epinefrine (1:100.000) wordt langzaam geïnjecteerd in een plaats net onder het dorsale oppervlak van het voorste gedeelte van de tong . De site van de anesthesie is distaal van de collectie plaats om storingen te voorkomen door de lidocaïne met latere studies. Ter vergelijking, de hoeveelheid lidocaïne ingespoten (0,25 ml) is ongeveer een kwart van de hoeveelheid die normaal gegeven voor zenuwblokkade in tandheelkundige ingrepen (0,8 ml tot 1 ml). Na het inbrengen van de naald, maar voor de injectie van het verdovingsmiddel, aspiratie zorgt ervoor dat er geen bloedvat is geraakt. Deze voorzorgsmaatregel is genomen, ook al is het anatomisch niet waarschijnlijk dat een groot schip zal dicht bij het dorsale oppervlak worden gevonden. De enige slagaders op het dorsale oppervlak, de dorsale linguale slagaders zijn kleine bloedvaten voornamelijk gelegen meer posterior aan het voorste derde deel, waar het weefsel oogst plaatsvindt. De grotere linguale slagaders en de linguale aderen lopen op het ventrale oppervlak van de tong, ver verwijderd van het ruggedeelte ontvangen anesthesie 3. De 1 cm onder narcose gebied lijkt enigszins verbleken worden vergeleken met het omringende weefsel. Dit is te wijten aan de zwelling van het weefsel als het de kleine bloedvaten kompressen. Het is ook te wijten aan het vasoconstrictieve effect van de adrenaline. Na ongeveer een minuut, wordt een sonde gebruikt om de ruimte voor gevoelloosheid test. Als het gebied is niet gevoelloos, kan een tweede injectie (0,1 tot 0,2 ml) worden gegeven.
3. Tong papillen verwijderen Techniek
- De voorste kwart van de tong van het onderwerp wordt verpakt in een steriel gaasje (figuur 1) en hield in de linkerhand van de chirurg (als het uitvoeren van de biopsie met de rechterhand). Een hoek van het gaas wordt opengelaten, zodat de chirurg de tong vrij van speeksel af te vegen. De tong moet vast worden gehouden, maar, uiteraard, niet om zo onnodig ongemak te veroorzaken. Het topje van de wijsvinger van de linkerhand wordt gepositioneerd onder de tong direct onder de plek waar de biopsie wordt uitgevoerd. Door het indrukken van de wijsvinger naar boven, de tong wordt gespannen over het topje van de vinger het maken van de papillen steken voor een eenvoudige biopsie.
- Criteria voor de keuze papillen voor biopsie: Taste papillen zijn gemakkelijk te onderscheiden van de omliggende filliform papillen door hun vorm en grootte. Fungiform papillen zijn rond en enigszins geïsoleerd van de omgeving. In hun directe omgeving is er een cirkelvormige ruimte zonder filliform papillen (Figuur 2A, blauwe pijlen). Deze ruimte is ongeveer 1 mm in diameter. Een ander onderscheidend kenmerk van de fungiform papillen is een uitgebreide capillaire arborization zichtbaar op de top van de meeste fungiform papillen van de jonge proefpersonen. Hoewel arborization maakt het lokaliseren fungiform papillen gemakkelijker, zijn ze niet per se een goede voorspellers van het bestaan van de smaakpapillen in die papilla. In de regel een begint het oogsten in de richting van het front-end en beweegt verder weg van het puntje van de tong op een capillaire bloeden vermijden verduistert de site van de volgende weefsel collectie.
- Zodra een goede papil is vastgesteld, een veer micro-schaar (McPherson-Vannas, gebogen, scherpe snijkant 5 mm, kam, tip breedte 0,2 mm totale lengte 3 "(RS-5603, Roboz) wordt gebruikt om het clip uit. Om effectief gebruik van de micro-chirurgische schaar moet men de punt van het mes niet gebruiken voor het snijden, maar eerder, wat binnen in het blad als mogelijk (zie figuur 1, vergrote beeld en figuur 3), dicht bij het snijpunt met het tegenovergestelde blad. Het verwijderen van de papil wordt bereikt met een snij beweging van de schaar (figuur 1). Hoe verder in de open messen de gerichte papil verschijnt, des te effectiever is het snijden. Zorg moet worden genomen dat de algemene positie van de schaar moet parallel worden met het dorsale oppervlak van de tong.
- Soms is de tong wordt droog als de chirurg probeert een papilla voor verwijdering te identificeren. Eenmaal droog, het vermogen van de operator om duidelijk te zien dat is een fungiform papil wordt uitdagender en maakt glijden van de bladen op de papil erg moeilijk. Een te droge tong maakt meestal de metalen blad vasthouden aan de tong waardoor de delicate chirurgische bewegen minder controleerbaar. Laten het onderwerp zeer dichtbij zijn / haar mond en zijn speeksel in aanraking komen met het oppervlak van de tong helpt het proces. Overdreven natte tong is ook niet goed. Met behulp van de hoek van het gaas dat men gebruikt om vast te houden de tong helpt in dit proces.
- Eventuele capillaire bloeden dat optreedt wordt behandeld door deppen met een steriel gaasje. Bloeden stopt meestal binnen een paar minuten Utes en interfereert niet met extra weefsel oogsten. Omdat de papillen te breiden boven de epitheliale oppervlak van de tong, en alleen de bovenste 3 / 4 van een fungiform papil is verwijderd (figuur 2B), dat een deel van de fungiform tonen smaakpapillen, is weinig bloeden verwacht.
- Met behulp van een klein pincet Dumont (Pattern type), worden de verwijderde papillen geplaatst in gekoelde basic Ringer-buffer (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na-Pyruvaat, 20 mM HEPES-Na , pH 7.2; osmolaliteit van ~ 305 milli osmols) voor verdere manipulaties. Het is noodzakelijk om NOOIT knijpen de papil tussen de bladen van een pincet. Het weefsel is zeer breekbaar en moet behandeld worden met uiterste zorg.
- Na verwijdering van de papillen, het onderwerp blijft in de stoel voor tien tot vijftien minuten. Elk onderwerp wordt verteld niet te bijten op hun tong onder narcose, maar om hun tong laten rusten. Onderwerpen moeten visueel worden gecontroleerd door de behandelend chirurg. Anesthesie zal naar verwachting af te dragen in ongeveer 30-60 minuten. Omdat de site van de papillen verwijdering kan enigszins pijnlijk zijn na de biopsie, worden ze geïnstrueerd om bewust te zijn van pittig of heet (temperatuur) eten, koolzuurhoudende dranken of dranken die ofwel extreem koud of warm. Een verdere aanwijzing wordt gegeven aan onderwerpen die een lichte rode verkleuring van speeksel is normaal en zal ophouden bij ontbinding van het stolsel.
- Onderwerpen worden gezien 30-40 dagen na verwijdering van de papillen voor de beoordeling van de plaats waar de papillen werden verwijderd. Tegen die tijd smaak papillen moeten volledig zijn geregenereerd.
5. Representatieve resultaten
Verzamelde weefsel kan worden gebruikt voor immunohistochemie, RT-PCR, in situ hybridisatie, calcium beeldvorming, patch klem-en weefselkweek. Wanneer deze wordt uitgevoerd juist het uiterlijk van de papillen zijn gezond uitziende, witte, ongeveer 0,5-1 mm in diameter (figuur 2B).
Papillen verzameld voor immunohistochemie worden verwerkt op basis van bestaande en gepubliceerde protocollen 4. Een typische smaak knop van een paraformaldehide-vaste smaak papillen is weergegeven in figuur 4A.
Biopsie papillen kunnen ook enzymatisch behandeld worden 5 tot dissociatie van smaakknop cellen te bereiken. Na de enzymatische dissociatie, kunnen cellen worden gehandhaafd tot 4 uur in een vochtige petrischaal op 4C. In deze staat ze gebruikt kunnen worden voor single cell PCR (figuur 4B), Ca-imaging, etc.
Cellen vertonen een verscheidenheid van vormen, veel te slank en bipolaire (figuur 5A en 5B) als men zou verwachten van een smaakpapil cel. Bij het verzamelen van cellen of het uitvoeren van Ca-imaging, na ongeveer 20 minuten onder een microscoop, de cellen beginnen te apoptotische blebs (figuur 6A en 6B, pijlen) en velen van hen rond te ontwikkelen. Met behulp van een techniek ontwikkeld in ons laboratorium werden de cellen opgehaald individueel met behulp van een patch-pipet, zoals weergegeven in figuur 5A en 5B.
Zoals hierboven vermeld, papillen beginnen teruggroeien na 5 tot 8 weken. Figuur 7A toont de verschijning van een tong waar 8 fungiform papillen werden verwijderd uit de linkerkant een vrijwilliger de tong met behulp van geen verdoving. Merk op 8 kleine rode vlekjes, waar de papillen werden afgeknipt. Geen bloeden is waargenomen na de operatie. De huidige foto werd genomen 10 minuten na de biopsie. Figuur 7B is een beeld van de tong van hetzelfde onderwerp gezien 40 dagen na de biopsie. Merk op alle papillen hebben regrown. Om te bepalen of de geregenereerde papillen zijn functioneel vroegen we ons vrijwillig in te stemmen met een tweede biopsie waarbij exact dezelfde papillen. Om correct te identificeren van de juiste papillen waren we van plan om opnieuw de oogst, genereerden wij een rooster (figuur 7C) dat de 8 papillen die werden verwijderd in de eerste plaats en bovenop het over de tong van de dezelfde vrijwilligers na 40 dagen na de initiële biopsie past . Geholpen door de contour van de tong en de afstand van de marge naar de grid, eenmaal geïdentificeerd, hebben we verwijderd, een paar van de exact dezelfde papillen en verwerkt ze voor immunohistochemie. Figuur 4A is een van deze papillen. Let op de omtrek van een smaakpapil (in geel) en de immunopositive aankleuring voor Fosfolipase Cβ2 (PLCβ2), een type 2 proeven cel transductie-geassocieerde enzym. Deze gegevens tonen aan dat het gebruik van de biopsie procedure zoals hier beschreven, voldoende de fungiform papillen regenereren met 40 dagen de tijd om ook op zijn plaats waarschijnlijk functionele smaakpapillen.
Figuur 1. De voorste kwart van de tong van het onderwerp is verpakt in steriele gaas en hield in de linkerhand van de chirurg. Tong moet vast worden gehouden. Het vergrote beeld aan de rechterkant ziet u de juiste positie van de schaar en de positie van de papil in relatie tot het blad.
201/2201fig2.jpg "alt =" Afbeelding 2 "/>
Figuur 2. (A) Fungiform papillen worden getoond met blauwe pijlen. Dit zijn ronde structuren enigszins geïsoleerd van de omgeving en in hun directe omgeving is er een cirkelvormige ruimte zonder filliform papillen. (B) Fungiform smaak papillen op het puntje van de veer micro-schaar seconden nadat het is verwijderd.
Figuur 3. Zelf biopsie van een fungiform papil met behulp van een spiegel en geen verdoving. De inzet toont de algemene positie van de schaar, die moet worden parallel met de dorsale oppervlak van de tong. Als dit goed en atraumatisch gedaan, wordt verdoving gederfde door vrijwel alle vrijwilligers.
Figuur 4 A. Immunohistochemie van een smaakpapil. Een fungiform papilla gevisualiseerd door Nomarski optiek met behulp van antilichamen aan fosfolipase β2 en gelabeld met Red Fluorescent Protein. De omtrek van de smaak knop en een paar gelabelde smaak cellen worden weergegeven in het geel. 
B. RT-PCR van een kandidaat-zure smaak receptor, Acid Sensing Ion Channel 1 (ASIC1). M = marker. Lanen 1 tot en met 4 zijn enkele cel RT-PCR voor ASIC1 uit vier verschillende vrijwilligers. Na het verzamelen, fungiform papillen werden enzymatisch gescheiden, cellen individueel opgepakt en de expressie van ASIC1 werden gedaan. Lanen 2 en 4 hadden een normale uiting van ASIC1.
Figuur 5. A. Afbeelding van enkele smaak cellen worden opgepakt met behulp van een patch pipet. Een grote epitheliale cel is zichtbaar in de linker benedenhoek (5A). Twee rode bloedcellen zijn ook zichtbaar boven de patch pipet en achter het glas vat. De smaak cel is ongeveer 30-50 micrometer lang en ongeveer 6 micron breed. Ter referentie, een rode bloedcel is ongeveer 7-8 micron in diameter. B. toont een andere smaak receptor cel, omringd door vier epitheelcellen. De smaak cel ziet er haarscherp.
Figuur 6. A. Beelden van cellen die begon te apoptotische blebs (spook zoals ronde blebs aan de smaak cel, pijlen) te ontwikkelen. B. De cellen zijn niet meer geoogst wanneer hun uiterlijk verandert zoals hier te zien.
Figuur 7. A. Tien minuten na het verwijderen van 8 smaak papillen met geen verdoving. De chirurgische sites zijn zichtbaar als lichte rode vlekken. Geen bloeden is opgevallen.
B. Dezelfde tong 40 dagen na biopsie. Merk op alle papillen geregenereerd. Om u te helpen identificeren van de verwijderde papillen als regrown, werd een rooster gemaakt met de site aan de rechterkant beeld en verschoven over de geregenereerd papillen aan de linkerkant beeld.
C. De geregenereerde papillen verscheen in exact dezelfde plek. Oogsten papillen weer uit deze groep, gevolgd door immunohistochemie aangetoond dat de geregenereerde papillen functionele smaak cellen bevat (zie figuur 4A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een opmerkelijke voordeel van het gebruik van menselijke cellen is hun specificiteit. De hier beschreven procedure in detail biedt tong weefsel voor het isoleren van smaak receptor cellen van de mens. Deze smaak cellen kunnen worden gebruikt voor moleculaire studies, die om moleculen te belangrijk voor de transductie van smaak informatie te ontdekken, en voor calcium imaging studies die smaak cel activiteit monitor aan stimuli. Bovendien kan de tong weefsel door deze procedure worden geanalyseerd met verschillende technieken, zoals immunohistochemie, in situ hybridisatie, en maakt het vastleggen van de individuele cellen voor moleculaire procedures, zoals Polymerase Chain Reaction (PCR), inclusief real-time kwantitatieve PCR Single Cell. Omdat deze procedure kan worden uitgevoerd op personen van wie de smaak kan psychophysically worden geëvalueerd voorafgaand aan de biopsie, is het mogelijk om een duidelijk beeld van de moleculaire details die verantwoordelijk is voor de smaak afwijkingen (zie bijvoorbeeld Huque et al.. 2009). Deze biopsie procedure kan de productie van een levensvatbaar en metabool intacte cel voorbereiding verrijkt met cellen van smaakpapillen en dus de mogelijkheid om patch clamp opnames uit te voeren op deze cellen. Met behulp van deze techniek, zouden toekomstige studies verhogen niet alleen ons begrip van smaak transductie processen die uniek zijn voor de mens, maar ook ontcijferen moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen smaak afwijkingen in ziekte of medicatie-geïnduceerde staten en regimes te ontwikkelen om deze afwijkingen te behandelen.
Tot slot, de resultaten van onze waarnemingen zijn sterke aanwijzingen dat de aanwezigheid van "gaten", vaak vermeld op fungiform papillen dicht bij arborizations en over het algemeen beschouwd als smaakknop poriën, zijn in feite niet goed voorspellers van het bestaan van de smaakpapillen. Precies wat de aard van deze gaten is, of wat functies die ze kunnen uitvoeren, we weten het niet.
In 8 jaar geleden dat we begonnen met deze procedure, hebben we herhaaldelijk verzameld van enkele tientallen vrijwilligers meer dan 4000 smaak papillen. Twee negatieve incidentie, beide geassocieerd met de plaatselijke verdoving heeft geleid tot een tijdelijke zwelling van de tong, maar opgelost binnen de komende 48 uur zonder nadelige gevolgen. Als dit goed wordt gedaan, onder steriele en atraumatische voorwaarden, deze methode is veilig en effectief is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH R21 DC03969-01 (tot JGB). Wij danken dr. Fritz Lischka voor het vastleggen van enkele smaakpapil cellen, Dr Tauf Huque voor het uitvoeren van de RT-PCR zie figuur 4B en de heer D. Bayley en mevrouw S. Alarcon voor technische ondersteuning. M. Yanina Pepino is een mede-ondersteund door een NIDAT32 DA07313 Washington University School of Medicine, St. Louis, MO (Cottler, LB PI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McPherson-Vannas. Curved, sharp cutting edge 5mm. Comb, tip width 0.2 mm overall length 3" | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5603, Roboz | |
| Small Dumont forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4915, Roboz |
References
- Breslin, P. A., Spector, A. C.
- Miller, I. Anatomy of the peripheral taste system. Handbook of Olfaction and Gustation. Doty, R. I., Dekker, M. , Marcel Dekker. New York. 521-547 (1995).
- Figure 12.67. Gray's Anatomy: The Anatomical Basis of Medicine and Surgery. , 38th Edition, Churchill Livingstone. New York. (1995).
- Huque, T., Cowart, B. J., Dankulich-Nagrudny, L., Pribitkin, E. A., Bayley, D. L., Spielman, A., Feldman, I., S, R., Mackler, Sour ageusia in two individuals implicates ion channels of the ASIC and PKD families in human sour taste perception at the anterior tongue. PLoS One. 4 (10), e7347-e7347 (2009).
- MacDonald, J. F., Mody, I., Salter, M. W., Spielman, A. I.
