技术收集人舌菌状（味道）乳头

Summary

基本味觉转导的分子机制方面的知识最近享受到了重大进展，主要是由于使用动物模型。然而，在味觉的灵敏度和特异性哺乳动物认股权证在人体组织的研究广泛​​的多样性。我们描述了一个活检技术，收集从对人舌乳头的生活品位细胞。

Abstract

味觉是人类生活的关键。通知将潜在摄入的食物质量的身体和刺激，准备消化道的消化代谢过程。对了解早期生物化学和分子事件的基本味道传导（检讨，布雷斯林和斯佩克特，2008年^1）正在取得稳步进展。然而，迄今取得的进展在很大程度上导致动物模型。然而，由于在受体特异性和受体密度显着差异有所不同物种之间，人类的味道传导只会被理解，使用人类的味道组织。在这里，我们描述了一个活检技术，人类菌状乳头，可见圆形粉红色的前结构，收集包含味蕾直径约0.5毫米。这些切片乳头被用于多种用途，包括可行的味蕾细胞的分离 ，原位杂交，免疫组织化学，并通过分子生物学技术的，识别特定味道的新型蛋白质。

Protocol

1。介绍和一般注意事项

一般程序包括一个小的（1厘米^2）面积的前舌背表面，去除一个（6-8）（味）的菌状乳头的数量，麻醉面积使用一个弯曲的弹簧微局部麻醉 - 剪刀（麦弗逊式Vannas类型＃简5603，Roboz，罗克维尔，医学博士）。删除的菌状乳头约0.25 ^毫米的 3个。有很少的非乳头（味道）去除上皮组织的每个乳头。新乳头的形式，在这一领域经过3至5个星期，恢复运作的味蕾（斯皮尔曼和品牌，未发表意见）。这少量的味道材料取出后的食物的味道或味道上有没有明显的效果。从个别成人人类的舌头的味蕾已经算的研究，可以预计，人类的舌头包含约5000个味蕾。我们的程序中删除这些味蕾大部分在20 25（平均3.5％至4菌状乳头味蕾在人力^）2，或总数的约0.4％。此外，还有与这个组织的手术损失没有相关的疼痛。一个感觉，当然，仅在注射部位轻微疼痛，针进入舌头。麻醉消失后，不到一天的时间，偶尔轻度不适，但这种不适是比什么之一的经验后，意外地“咬”的舌头少得多。

在过去的几年中，我们已经开发了一个替代的过程，不包括麻醉。是两个相同的组织切除技术。在程序中的唯一的区别是，外科医生已不再局限于一个^1厘米直径2地方的麻醉处理。而他/她可以选择突出的乳头出现舌背表面上的任何站点。删除乳头总数6-8，在这两种技术是有限的，如果正确执行或不麻醉，，取消6-8的菌状味道乳头的不适被认为是一个问题与管理相关的疼痛比较少一般调查的个人经历了两个程序，即局部麻醉，无需麻醉，结果显示，绝大多数科目将免除没有局部麻醉在今后所有的活组织切片检查。外科医生开发的这种技术（AIS）的，由作者进行活检无需麻醉授课的几位同事，都试图在自己和作证的不适是暂时的，被认为是小于的咬自己的舌头。最后，几十个人同意将活检，问他们是否愿意尝试去除没有麻醉的一个乳头，如果他们判断它是太痛苦了，他们将接受麻醉，都同意的情况下继续与去除乳头麻醉。

整个活检不应该需要更长的时间超过5-10分钟。如果采用麻醉另外2-3分钟。活检通常是在清晨进行。活检前，志愿者们指示预定开始时间前两小时吃一个便餐。活检，获得书面知情同意。活检时的排除标准包括那些患有严重的慢性疾病，是否用药或不控制（例如，任何胃肠道疾病，神经退行性疾病，肿瘤，血液恶液质，麻药过敏等），心率大于100或小于60，收缩压大于145或小于100，舒张压大于90或小于60，和外科医生的意见，可以参与这项研究的主题。

最后，重要的是要考虑在相同的设施，组织将检查处理，自组织的完整性正在迅速失去正如我们经常指出的mRNA质量下降，应进行活检。为了最大限度地减少这些问题的舌组织应尽快处理。

2。除准备

1. 主体是在牙科椅或头枕座位就座。
2. 检查活检时心率和血压。受血压，心率或口头的能力范围之外的下降，医生建议他/她看医生立即任命的主体。
3. 一般组织的健康检查口腔，注意口干舌，地域或任何舌病变的指标。口腔疾病的迹象显示，包括舌的病变或口干任何问题都排除在研究之外。指示须用清水冲洗口，免除所有的口头cavit碎片Y.如果有必要的舌头清洁一次性舌刮板清除牙菌斑或碎片，这可能是舌头在注射麻醉。在戴手套的手外科医生使用无菌纱布举行的舌头的前荐，因为它从口腔延伸。
4. 如果使用麻醉，与28计1CC结核菌素注射器x半“针肾上腺素（1:100000）含有0.25毫升利多卡因（2％）是慢慢注入到一个站点略低于舌头的前部分的背水面。远端收集站，以避免干扰与随后的研究利多卡因麻醉网站。相比之下，利多卡因注射量（0.25毫升）约一季度通常用于牙科手术的神经块（0.8毫升至1 mL）的金额。愿望后插入针，但注射麻醉剂前，确保没有血管袭击。这是采取预防措施，即使它在解剖学上不可能的大型船只将被击中的背水面。唯一的背水面上动脉，舌背动脉小血管主要位于后到前的三分之一，组织收割时的船只。较大的舌动脉和舌静脉，舌腹面上运行，远离背接受^麻醉 3的面积。 1厘米麻醉的面积，似乎与周围组织相比略显苍白。这是由于组织，因为它压缩的小血管肿胀。这也是由于肾上腺素的缩血管作用。大约一分钟后，一个探头用于测试的麻木区。如果面积不麻木，第二次注射（0.1〜0.2毫升），可给予。

3。舌乳头去除技术

1. 前季舌的主体是用无菌纱布包裹成（图1）和外科医生的左手（如果进行活检，用右手）举行。纱布的一角是开放的，允许外科医生擦拭唾液的舌头。舌头必须牢牢的，但是，当然，并非如此，造成不必要的不​​适。左手食指的尖端定位下的直接领导下进行活检网站舌。食指向上推，舌头变得拉长以上的手指使乳头坚持便于活检提示。
2. 选择乳头活检的标准：味道乳头filliform乳头周围很容易分辨，它们的形状和大小。菌状乳头是圆的，从周围有点孤立。在他们眼前的附近有一个圆形的空间，没有filliform乳头（图2A，蓝色箭头）。这个空间是直径约1毫米。菌状乳头的另一个显着特点是扩展的毛细血管分枝上最年轻的学科菌状乳头顶部可见。虽然树枝状定位菌状乳头更容易，他们不一定的，乳头中的味蕾存在的良好的预测。作为一项规则，开始走向前端的收获，并进一步远离舌尖，从模糊的未来组织收集的网站，以避免任何毛细血管出血。
3. 一旦一个很好的乳头已经确定，春季微型剪刀（麦弗逊式Vannas，5毫米，梳子，先端宽0.2毫米的总长度3“（RS - 5603，Roboz）是用来把它夹弯曲，锋利的尖端。为了有效地利用微型手术剪，不应使用切割刀片的一角;，而是尽量在刀片（图1，放大的图像，图3）尽可能接近的交点，与对面的刀片。去除乳头是实现用剪刀切割移动（图1）。应采取剪刀的整体状况，必须平行进一步针对性的乳头出现开放的刀片内，更有效的切割。舌背表面。
4. 有时候舌头会变得干燥，当医生是试图找出一个去除乳头。干燥后，运营​​商能够清楚地看到这是一个菌状乳头变得更具挑战性，在非常困难的乳头刀片滑动。过于干燥的舌头通常使金属刀片粘舌细腻的手术动作少可控。让主题接近他/她的嘴，并与舌表面接触唾液，有助于这一进程。过于潮湿的舌头也不好。在此过程中使用的纱布，用来存储舌角落帮助。
5. 确实发生任何毛细血管出血治疗用无菌纱布印迹。出血通常几个分钟内停止犹特和不干预其他组织收割。由于乳头延长以上的舌头的上皮表面，只有一个菌状乳头上3 / 4被删除（图2B），这部分的味蕾菌状，出血少的预期。
6. 用一个小镊子杜蒙（模式类型），删除乳头被放置在冷冻基本林格氏缓冲液（氯化钠130毫米，1毫米_氯化钙 ，氯化钾，5毫米1毫米氯化镁_2，1毫米钠丙酮酸，20毫米的HEPES - NA ，pH值7.2〜305毫osmols渗透压为后续的操作）。切勿捏一个镊子刀片之间的乳头，这是势在必行。该组织是很脆弱的，并应特别小心处理。
7. 搬迁后的乳头，主体保持在10到15分钟的椅子上。每个主题被告知不咬其麻醉的舌头，但为了保持他们的舌头在休息。科目应视觉监控由主治外科医生。麻醉预计穿在大约30-60分钟。由于乳头拆除现场活检后可能会略有酸痛，指示他们要知道辛辣或热（温度）的食品，碳酸饮料或饮料，是极冷或极热。进一步表明，受试者的唾液，任何轻微的偏红的色彩是正常的，将血块溶解后停止。
8. 主题被视为评价的乳头被拆除现场的乳头上除名后的30-40天。这个时候的味道乳头已经完全再生。

5。代表性的成果

组织收集可用于免疫组织化学，RT - PCR技术， 原位杂交，钙成像，膜片钳和组织文化。当正确执行乳头的外观是健康的，白色，直径约0.5-1毫米（图2B）。

乳头进行免疫组化收集处理的基础上现有的和发布的协议^4。一个典型的味蕾，从paraformaldehide固定的味道乳头如图4A所示。

活检乳头也被酶治疗⁵实现味蕾细胞分解。酶解后，细胞可维持在加湿的培养皿至4小时，在4C。在这种状态下，他们可用于单细胞PCR（图4B），钙成像等

细胞显示出各种形状，许多细长和双极性（图5A和5B）正如人们所预料的味蕾细胞。当收集细胞进行钙成像，经过约20分钟，在显微镜下后，细胞开始凋亡滤过泡（图6A和6B，箭头），其中许多人成为一轮。在我们的实验室开发出一种技术，细胞拿起单独使用一个补丁移液器，图5A和5B所示。

如上所述，乳头开始5至8周后再生。图7A演示一个使用无需麻醉，从左侧删除志愿者的舌头8菌状乳头的舌头的外观。注意8轻微的淡红色斑点，乳头被剪断。无出血，手术后观察。本图像10分钟后活检。图7B是舌活检后40天看到同一主题的形象。请注意所有的乳头已经重新长出。要确定是否再生乳头功能，我们要求我们的志愿者同意第二次活检涉及完全相同乳头。要正确地确定适当的乳头，我们计划再收获，我们生成一个网格（图7C），适合8乳头被拆除摆在首位，后40天，最初活检后叠加在同一志愿者的舌头。借助舌头的轮廓和从边缘到电网的距离，一旦确定，我们已删除了几个完全相同的乳头和免疫组化处理他们。图4A是其中一个乳头。请注意一个味蕾（黄色）和磷脂Cβ2（PLCβ2），2型味觉细胞转导相关的酶免疫阳性染色的轮廓。这些数据表明，使用本文所述的活检，菌状乳头再生40天，充分也有可能功能的味蕾。

图1。前季度舌的主体是进入无菌纱布包裹，并在外科医生的左手举行。舌头必须坚守。在右边的放大的图像显示的剪刀和刀片乳头的位置适当的位置。

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图2。 （一）菌状乳头带有蓝色箭头所示。这是有点孤立的圆形结构及其周围，并在其紧邻的是一个圆形的空间缺乏filliform乳头。 （二）菌状乳头微型剪刀秒后，它已被删除领略春天的一角。

图3。自活检使用一面镜子，没有麻醉的一个菌状乳头。插图说明剪刀的整体状况，必须与舌背表面平行。如果做得正确和atraumatically，麻醉放弃几乎所有的志愿者。

图4 A免疫组织化学的一个味蕾。一个菌状乳头可视化磷脂β2Nomarski使用抗体的光学和红色荧光蛋白标签。味蕾和几个标记的味觉细胞的轮廓显示为黄色。

- PCR候选人酸味受体，酸敏感离子通道（ASIC1）B. RT。 M =标记。 1到4车道，单细胞RT - PCR方法从四个不同的志愿者的ASIC1。集合后，菌状乳头酶分离，细胞单独拿起ASIC1表达。泳道2和4 ASIC1的正常表达。

图5。 A.单味细胞图像拿起使用补丁吸管。一个大的上皮细胞是在左下角（5A）可见。两个红血细胞，也可见上述补丁吸管和后面的玻璃桶。味觉细胞是约30-50微米长，宽6微米左右。仅供参考，红血球直径约7-8微米。 B.显示了另一种味觉受体细胞，周围四个上皮细胞。味觉细胞看起来明快。

图6。答：图像的细胞开始研制凋亡滤过泡（鬼一样的味觉细胞，箭头的圆形滤泡）。 B.细胞不再收获时，其外观上的变化如下所示。

图7。 A.十几分钟后，8味道乳头不使用麻醉的去除。手术部位可见的略微泛红的斑点。注意到没有出血。
B.活检后40天的舌头。请注意所有的乳头再生。为了帮助确定删除重新长出乳头，与网站创建一个网格右侧的图片，并在左侧图像再生乳头转移。
C.再生乳头出现在完全相同的位置。收获乳头再次表明，再生的乳头载功能的味觉细胞（图4A）的免疫组织化学组。

Discussion

使用人体细胞的一个显着的优势是其特殊性。在这里详细介绍的过程提供了来自人类的味觉受体细胞的分离舌组织。这些味觉细胞，可用于分子生物学研究，试图发现味觉信息传导的重要分子，监测活动，以刺激味觉细胞的钙成像研究。此外，此过程中提供的舌组织可与各种技术， 如原位杂交，免疫组织化学分析，并允许捕捉如聚合酶链反应（PCR）技术，包括实时定量单细胞PCR的分子程序的单个细胞。由于此过程可在人的味觉可以psychophysically评估活检前进行的，它是可以得到一个明确的负责味觉异常（例如，看到Huque等人，2009年）的分子细节的图片。这活检程序允许一个可行的和代谢完整的单细胞味蕾细胞丰富的准备，从而有能力执行这些细胞的膜片钳记录的生产。使用这种技术，未来的研究，不仅增加我们了解的味觉传导过程的独特的人，但也破译潜在的疾病或药物诱导的状态和发展方案来处理这些异常的味觉异常的分子机制。

最后，我们的观察结果表明，存在“漏洞”，常常注​​意到菌状乳头接近到arborizations，通常被认为是味蕾毛孔，事实上，不存在味蕾良好的预测。这些漏洞的性质究竟是什么，或者他们可能会执行什么功能，我们不知道。

在8年以来，我们开始此过程，我们已多次收集到4000多味乳头的数十名志愿者。两个不良的发病率，与局部麻醉相关领导的临时肿胀的舌头，但在未来48小时内内解决，没有任何不良影响。如果做得好，无菌和无创伤条件下，这种方法是安全有效的。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McPherson-Vannas. Curved, sharp cutting edge 5mm. Comb, tip width 0.2 mm overall length 3"	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5603, Roboz
Small Dumont forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4915, Roboz