Summary
Conoscenza dei meccanismi molecolari alla base di trasduzione gustativa ha recentemente goduto di significativi passi avanti, soprattutto grazie all'utilizzo di modelli animali. Tuttavia, la grande diversità di sensibilità e specificità tra gusto garantisce mammiferi studi nel tessuto umano. Descriviamo una tecnica di biopsia per raccogliere cellule gustative viventi dalle papille sulla lingua umana.
Abstract
Il senso del gusto è fondamentale per la vita umana. Si informa il corpo circa la qualità del cibo che sarà potenzialmente ingerito e stimola i processi metabolici che preparano il canale alimentare per la digestione. Costanti progressi si stanno compiendo verso la comprensione degli eventi biochimici e molecolari primi sottostante trasduzione del gusto (per una rassegna, Breslin e Spector, 2008 1). Tuttavia, i progressi fino ad oggi è in gran parte il risultato di modelli animali. Tuttavia, dal momento che marcate differenze nella specificità del recettore e la densità dei recettori variano da specie a specie, trasduzione gusto umano essere compresa solo utilizzando tessuti umani gusto. Qui si descrive una tecnica di biopsia per raccogliere umano papille fungiformi, visibili come strutture rosa anteriori arrotondati, di circa 0,5 mm di diametro che contengono le papille gustative. Queste papille biopsie sono utilizzati per scopi diversi tra cui l'isolamento delle cellule vitali papille gustative, ibridazione in situ, immunoistochimica e, attraverso tecniche di biologia molecolare, l'identificazione del gusto proteine specifiche del romanzo.
Protocol
1. Introduzione e considerazioni generali
La procedura generale prevede l'anestesia locale di un piccolo (1 cm 2) area della superficie dorsale della lingua anteriore, seguita da rimozione di un numero (6-8) di fungiformi (gusto) papille da quella zona anestetizzati con una curva primavera micro -forbici (McPherson-Vännäs tipo # SR 5603, Roboz, Rockville, MD). Il rimosso papille fungiformi sono circa 0,25 mm 3 ciascuna. C'è molto poco non papille (gusto) tessuto epiteliale rimosso con ogni papilla. Nuovo modulo papille in questo settore dopo 3 a 5 settimane e riprendere il funzionamento papille gustative (Spielman e Brand, osservazioni non pubblicate). Non vi è alcun effetto evidente sul gusto o sapore del cibo dopo la rimozione di questa piccola quantità di materiale gusto. Da studi che hanno contato papille gustative individuali nella lingua umano adulto, si può stimare che la lingua umana contiene circa 5000 papille gustative. La nostra procedura consente di rimuovere al massimo 20 a 25 di queste papille gustative (in media, ~ 3,5-4 papille fungiformi ogni papilla umani) 2, pari a circa lo 0,4% del totale. Inoltre non vi è dolore associato con la perdita chirurgica di questo tessuto. Ci si sente, ovviamente, un leggero dolore al sito di iniezione solo, come l'ago entra nella lingua. Dopo l'anestesia ha portato fuori, c'è il disagio di tanto in tanto mite per meno di un giorno, ma questo disagio è molto meno di quello che si sperimenta dopo accidentalmente "morde" la lingua quelle.
Negli ultimi anni abbiamo sviluppato una procedura alternativa che non include l'anestesia. La tecnica per la rimozione dei tessuti è identico per entrambi. L'unica differenza nella procedura è che il chirurgo non è più confinata ad un centimetro di diametro 1 2 zona in cui è stato affrontato l'anestesia. Piuttosto s / he può scegliere qualsiasi sito sulla superficie dorsale della lingua in cui papille prominenti apparire. Il numero totale di papille rimosse sono limitate a 6-8 in entrambe le tecniche, con o senza anestesia se eseguito correttamente, il disagio di rimuovere 6-8 papille gustative fungiformi è considerato un problema minore se confrontato con il dolore associato con la somministrazione di anestesia locale Un'indagine generale di individui che hanno subito entrambe le procedure, cioè, con e senza anestesia, ha dimostrato che la stragrande maggioranza dei soggetti si dispensano senza anestesia locale in tutte le biopsie futuro. Il chirurgo che ha sviluppato questa tecnica (AIS) e diversi colleghi insegnato dall'autore che ha eseguito biopsie senza anestesia, hanno provato su se stessi e testimoniano che il disagio è temporaneo ed è considerata inferiore a quella di mordersi la lingua. Infine, decine di persone che hanno accettato di essere sottoposte a biopsia è stato chiesto se sarebbero disposti a provare la rimozione di una papilla senza anestesia e se lo ritengono di essere troppo doloroso che subirebbe l'anestesia, hanno tutti convenuto di proseguire con la rimozione delle papille senza anestesia.
L'intero biopsia non dovrebbe richiedere più di 5-10 minuti. Se l'anestesia è impiegato altri 2-3 minuti viene aggiunto. La biopsia viene generalmente effettuata nelle prime ore del mattino. Prima della biopsia, i volontari sono incaricati di mangiare un pasto leggero due ore prima dell'ora di inizio prevista. Alla biopsia, il consenso informato scritto è ottenuta. I criteri di esclusione, al momento della biopsia includono quelli con gravi malattie croniche, sia sotto controllo farmacologico o non (ad esempio, eventuali malattie gastrointestinali, malattie neurodegenerative, tumori, discrasie ematiche, allergia al anestetici locali, ecc), quelli con frequenza cardiaca superiore a 100 o meno di 60; pressione sistolica maggiore di 145 o inferiore a 100; pressione diastolica superiore a 90 o meno di 60, e il parere del chirurgo che il soggetto può partecipare allo studio.
Infine, è importante considerare che la procedura di biopsia dovrebbe essere effettuata nella stessa struttura dove il tessuto verranno trattati per l'esame in quanto l'integrità dei tessuti sta rapidamente persa, come abbiamo più volte notato dalla qualità diminuzione di mRNA. Per minimizzare questi problemi il tessuto della lingua devono essere trattati il più rapidamente possibile.
2. Preparazione soggetto
- Il soggetto è seduto su una poltrona o un posto a sedere con un poggiatesta.
- Controllare la frequenza cardiaca e la pressione arteriosa al momento della biopsia. Se dovesse cadere soggetto al di fuori del campo della pressione arteriosa, frequenza cardiaca o di una competenza orale, il chirurgo consiglia al soggetto che lui / lei prendere appuntamento immediato vedere un medico.
- Ispezionare la cavità orale per la salute dei tessuti generale, con particolare attenzione agli indicatori di xerostomia, della lingua geografica o eventuali lesioni della lingua. Qualsiasi soggetto che mostra segni di patologie orali, comprese lesioni della lingua o della xerostomia sono esclusi dallo studio. Istruire il soggetto a sciacquare la bocca con acqua per rimuovere tutti i detriti dalla cavità oraley. Se necessario, la lingua è pulita con un scrapper lingua usa e getta per rimuovere la placca o detriti, che potrebbe essere portato in lingua durante l'iniezione dell'anestesia. Il chirurgo utilizza tamponi di garza sterile in una mano guantata di tenere il quarto anteriore della lingua che si estende dalla cavità orale.
- Se l'anestesia viene utilizzata, una siringa tubercolina 1cc con un calibro 28 x ½ 'ago contenente 0,25 ml di lidocaina (2%) con adrenalina (1:100.000) viene iniettata lentamente in un sito appena sotto la superficie dorsale della porzione anteriore della lingua . Il sito di anestesia è distale al sito di raccolta per evitare interferenze con la lidocaina con studi successivi. Per confronto, la quantità di lidocaina iniettata (0,25 ml) è circa un quarto della quantità normalmente dato per il blocco del nervo a procedure dentali (0,8 ml a 1 ml). Dopo l'inserimento dell'ago, ma prima dell'iniezione dell'anestetico, aspirazione assicura che nessun vaso sanguigno viene colpito. Questa precauzione è presa anche se è anatomicamente improbabile che una nave di grandi dimensioni sarà colpito vicino alla superficie dorsale. Le arterie solo sulla superficie dorsale, le arterie dorsali lingue sono piccoli vasi sanguigni in primo luogo situato più posteriormente al terzo anteriore, dove la raccolta dei tessuti si verifica. Le arterie più grandi lingue e le vene linguali correre sulla superficie ventrale della lingua, lontana dalla zona dorsale ricevere anestesia 3. Il 1 area centimetri anestetizzati sembra essere leggermente pallido rispetto al tessuto circostante. Ciò è dovuto al rigonfiamento del tessuto in quanto comprime i piccoli vasi sanguigni. E 'anche per l'effetto vasocostrittore della epinefrina. Dopo circa un minuto, una sonda viene utilizzata per testare l'area di intorpidimento. Se l'area non è insensibile, una seconda iniezione (da 0,1 a 0,2 ml) può essere somministrato.
3. Lingua Papille tecnica di rimozione
- Il quarto anteriore della lingua del soggetto è avvolto in una garza sterile (Figura 1) e tenuto nella mano sinistra del chirurgo (se si esegue la biopsia con la mano destra). Un angolo della garza viene lasciata aperta per permettere al chirurgo di pulire la lingua senza saliva. La lingua deve essere tenuto fermamente, ma, naturalmente, non in modo tale da causare disagio inutili. La punta del dito indice della mano sinistra è posizionata sotto la lingua direttamente sotto il sito in cui viene eseguita la biopsia. Premendo il dito indice verso l'alto, la lingua diventa tesa sopra la punta del dito facendo le papille sporgere per una facile biopsia.
- Criteri per la scelta papille per la biopsia: papille gustative sono facilmente distinguibili dalle circostanti filliform papille dalla loro forma e dimensione. Papille fungiformi sono rotondi e un po 'isolata dal circostante. Nelle loro immediate vicinanze vi è uno spazio circolare privo di filliform papille (Figura 2A, frecce blu). Questo spazio è di circa 1 mm di diametro. Un'altra caratteristica distintiva delle papille fungiformi è estesa arborizzazione capillare visibile sulla parte superiore della maggior parte delle papille fungiformi soggetti giovani. Anche se arborizzazione rende più facile localizzare papille fungiformi, non sono necessariamente buoni predittori dell'esistenza di papille gustative in quel papilla. Come una norma relativa raccolta inizia verso la fine anteriore e si allontana dalla punta della lingua per evitare emorragie capillari da oscurare il sito della collezione dei tessuti successiva.
- Una volta che un buon papilla è stata identificata, una molla micro-forbici (McPherson-Vännäs, curva, tagliente affilato 5 mm, pettine, larghezza punta 0,2 mm lunghezza 3 "(RS-5603, Roboz) è usato per tagliare fuori. Per utilizzare efficacemente le forbici micro chirurgico non si dovrebbe usare la punta della lama per il taglio, anzi, per quanto all'interno della lama il più possibile (figura 1, l'immagine ingrandita e la Figura 3), vicino al punto di intersezione con la lama opposta. La rimozione della papilla è realizzato con una mossa di taglio delle forbici (figura 1). ulteriormente all'interno delle pale aprire la papilla appare mirata, più efficace è il taglio. Prestare attenzione che la posizione complessiva delle forbici devono essere paralleli con la superficie dorsale della lingua.
- A volte la lingua diventa secco come il chirurgo sta cercando di identificare una papilla per la rimozione. Una volta asciutta, la capacità dell'operatore di vedere chiaramente che è un papille fungiformi diventa più impegnativo e fa scorrere delle pale sopra la papilla molto difficile. Una lingua troppo secco rende di solito lo stick lama metallica alla lingua di effettuare il passaggio delicato intervento chirurgico meno controllabili. Lasciando che il soggetto vicino il suo / la sua bocca e la saliva sono venuti a contatto con la superficie della lingua aiuta il processo. Eccessivamente lingua bagnata non è buono neanche. Utilizzando l'angolo della garza che si usa per tenere la lingua aiuta in questo processo.
- Qualsiasi sanguinamento capillare che si verifica è trattato tamponando con garza sterile. Il sanguinamento di solito si ferma a pochi min sce e non interferisce con la raccolta di tessuto aggiuntivo. Perché le papille estendono al di sopra della superficie epiteliale della lingua, e solo le superiori 3 / 4 di una papilla fungiformi viene rimosso (Figura 2B), quella parte del fungiform mostrando papille gustative, piccolo sanguinamento è previsto.
- Usando un piccolo Dumont pinza (tipo Pattern), le papille rimossi sono collocati in refrigerata tampone Ringer di base (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na-piruvato, 20 mM HEPES-Na , pH 7.2; osmolalità di circa 305 osmols millisecondi) per le manipolazioni successive. E 'imperativo per pizzicare MAI la papilla tra le lame di una pinza. Il tessuto è molto fragile e deve essere maneggiato con estrema cura.
- Dopo la rimozione delle papille, il soggetto rimane sulla sedia per 10-15 minuti. Ogni soggetto è detto di non mordere la lingua anestetizzata, ma per mantenere la loro lingua a riposo. Soggetti devono essere visivamente monitorato dal chirurgo curante. L'anestesia è previsto a svanire in circa 30-60 minuti. Perché il sito di rimozione papille potrebbe essere leggermente dolorante dopo la biopsia, sono istruiti a essere consapevoli di piccante o caldo (temperatura) alimenti, bevande gassate o bevande che sono o molto freddi o caldi. Un ulteriore indizio è dato a soggetti che ogni leggera colorazione rossastra della saliva è normale e cesserà in caso di dissoluzione del coagulo.
- I soggetti sono visti 30-40 giorni dopo la rimozione delle papille per la valutazione del sito in cui sono state rimosse le papille. In questo momento papille gustative dovrebbe avere completamente rigenerato.
5. Rappresentante Risultati
Tessuti raccolti possono essere utilizzati per l'immunoistochimica, RT-PCR, ibridazione in situ, l'imaging del calcio, patch di serraggio e coltura di tessuti. Quando eseguito correttamente l'aspetto delle papille sono sani cercando, bianco, circa 0,5-1 mm di diametro (Figura 2B).
Papille raccolti per immunoistochimica sono elaborati sulla base di protocolli esistenti e pubblicato 4. Una gemma da un gusto tipico paraformaldehide-fisso papilla gusto è mostrato nella figura 4A.
Papille biopsia può anche essere trattate enzimaticamente da 5 a raggiungere dissociazione delle cellule papille gustative. Dopo la dissociazione enzimatica, le cellule possono essere mantenute fino a 4 ore in un piatto umidificato Petri a 4C. In questo stato possono essere utilizzati per la PCR singola cellula (Figura 4B), Ca-imaging, ecc
Le cellule mostrano una varietà di forme, molti sono sottili e bipolare (Figura 5A e 5B), come ci si aspetterebbe da una cellula papille gustative. Quando si raccolgono le cellule o l'esecuzione di Ca-imaging, dopo circa 20 minuti al microscopio, le cellule iniziano a sviluppare vesciche apoptotici (Figura 6A e 6B, frecce) e molti di loro diventano rotonde. Utilizzando una tecnica sviluppata nel nostro laboratorio, le cellule sono state prelevati singolarmente con un patch-pipetta, come mostrato nella Figura 5A e 5B.
Come accennato in precedenza, papille cominciano a ricrescere dopo 5 a 8 settimane. 7A figura mostra l'aspetto di una lingua in cui sono stati rimossi 8 papille fungiformi dal lato sinistro lingua di un volontario senza utilizzare l'anestesia. Avviso 8 posti leggermente rossastro, dove sono state tagliate le papille off. Nessun sanguinamento si osserva dopo l'intervento chirurgico. L'immagine attuale è stata scattata 10 minuti dopo la biopsia. 7B figura è l'immagine della lingua dello stesso soggetto visto 40 giorni dopo la biopsia. Gara tutti papille sono ricresciuti. Per determinare se le papille rigenerati sono funzionali abbiamo chiesto ai nostri volontari di accettare una seconda biopsia che coinvolge le papille esattamente lo stesso. Per identificare correttamente le papille appropriato stavamo progettando di ri-raccolto, abbiamo generato una griglia (Figura 7C) che si inserisce l'8 papille che sono stati rimossi, in primo luogo e sovrapposti sopra la lingua del volontario stesso dopo 40 giorni dopo biopsia iniziale . Aiutato dal contorno della lingua e la distanza dal margine alla griglia, una volta individuato, abbiamo rimosso alcune delle papille stesse esatte e trattati per loro immunoistochimica. Figura 4A è una di queste papille. Si noti la sagoma di un papille gustative (in giallo) e la colorazione immunopositive per fosfolipasi Cβ2 (PLCβ2), a 2 celle gusto tipo di trasduzione associati enzima. Questi dati dimostrano che utilizzando la procedura biopsia come sopra descritto, le papille fungiformi rigenerare sufficientemente da 40 giorni per avere anche in luogo probabile papille gustative funzionale.
Figura 1. Il quarto anteriore della lingua del soggetto è avvolto in una garza sterile e tiene nella mano sinistra del chirurgo. Lingua deve essere tenuto saldamente. L'immagine ingrandita a destra mostra la posizione corretta delle forbici e la posizione della papilla in relazione alla lama.
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Figura 2. (A) papille fungiformi sono indicati con le frecce blu. Si tratta di strutture rotondo un po 'isolato dai suoi dintorni e nelle loro immediate vicinanze vi è uno spazio circolare privo di filliform papille. (B) papille fungiformi sapore sulla punta della primavera micro-forbici secondi dopo che è stato rimosso.
Figura 3. Auto biopsia di una papilla fungiformi utilizzando uno specchio e senza anestesia. L'inserto illustra la posizione complessiva delle forbici, che deve essere parallelo alla superficie dorsale della lingua. Se fatto correttamente e atraumatico, l'anestesia è rinunciato praticamente da tutti i volontari.
Figura 4 A. Immunoistochimica di un bocciolo gusto. Un papilla ottica fungiformi visualizzati da Nomarski utilizzando anticorpi fosfolipasi β2 e taggati con Red proteina fluorescente. Il profilo della gemma gusto e poche cellule gusto verranno indicati in giallo. 
B. RT-PCR di un recettore aspro sapore candidato, Acido Sensing Ion Canale 1 (ASIC1). M = marcatore. Corsie da 1 a 4 sono stati singola cellula RT-PCR per ASIC1 da quattro volontari diversi. Dopo la raccolta, papille fungiformi erano dissociate enzimaticamente le cellule singolarmente presi e espressione di ASIC1 sono stati fatti. 2 e 4 corsie erano espressione normale di ASIC1.
Figura 5. Immagine di A. cellule gustative singolo essere raccolto con una pipetta di patch. A grandi cellule epiteliali è visibile nell'angolo in basso a sinistra (5A). Due i globuli rossi sono visibili anche al di sopra della pipetta di patch e dietro la canna di vetro. La cella gusto è di circa 30-50 micron di lunghezza e circa 6 micron di larghezza. Per avere un riferimento, un globulo rosso è di circa 7-8 micron di diametro. B. mostra un altro recettore cellulare gusto circondato da quattro cellule epiteliali. La cella gusto aspetto croccante.
Figura 6. A. immagini di cellule che ha iniziato a sviluppare vesciche apoptotici (fantasma come vesciche intorno collegato alla cella di gusto, frecce). B. Le cellule non sono più raccolte quando il loro aspetto cambia come mostrato qui.
Figura 7. A. Dieci minuti dopo la rimozione di 8 papille gustative senza utilizzare l'anestesia. I siti chirurgici sono visibili come macchie leggermente rossastro. Assenza di sanguinamento è notato.
B. La lingua stessa 40 giorni dopo la biopsia. Gara tutti papille rigenerato. Per aiutare a identificare le papille rimosso come ricresciuti, una griglia è stata creata con il sito sull'immagine a destra e spostato oltre le papille rigenerato sull'immagine a sinistra.
C. Le papille rigenerato apparso nel punto esatto stesso. La raccolta papille ripartire da questo gruppo seguito da immunoistochimica ha dimostrato che le papille rigenerato contenute cellule gustative funzionale (vedi Figura 4A).
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Discussion
Un notevole vantaggio di utilizzare cellule umane è la loro specificità. La procedura descritta in dettaglio fornisce tessuto lingua per l'isolamento delle cellule gustative recettore dagli esseri umani. Queste cellule gustative possono essere utilizzati per studi molecolari, cercando di scoprire molecole importanti per la trasduzione di informazioni gusto, e per studi di imaging del calcio che monitorano l'attività delle cellule gusto agli stimoli. Inoltre, il tessuto lingua forniti da questa procedura possono essere analizzati con diverse tecniche come l'immunoistochimica, ibridazione in situ, e permette di catturare singole cellule per le procedure molecolare come la reazione a catena della polimerasi (PCR), tra cui Real Time PCR quantitativa cella singola. Poiché questa procedura può essere eseguita su individui il cui senso del gusto può essere psicofisica valutata prima di biopsia, è possibile avere un quadro chiaro dei dettagli molecolari responsabili di alterazioni del gusto (per esempio, vedere Huque et al. 2009). Questa procedura biopsia permette la produzione di una valida preparazione e metabolicamente intatto singola cellula arricchito in cellule di papille gustative, e quindi la possibilità di eseguire registrazioni di patch clamp su queste cellule. Utilizzando questa tecnica, gli studi futuri potrebbe non solo aumentare la nostra comprensione dei processi di trasduzione del gusto unico per l'uomo ma anche di decifrare i meccanismi molecolari alla base anomalie gusto nella malattia o farmaco-indotto gli stati e sviluppare terapie per il trattamento di queste anomalie.
Infine, i risultati delle nostre osservazioni indicano chiaramente che la presenza di "buchi", spesso notato su una stretta papille fungiformi di arborizzazioni e generalmente considerato pori papille gustative, sono, infatti, non buoni predittori dell'esistenza di papille gustative. Proprio quello che la natura di questi fori è, o quali funzioni si possono svolgere, non lo sappiamo.
In 8 anni da quando abbiamo iniziato questa procedura, abbiamo più volte raccolti da diverse decine di volontari oltre 4000 papille gustative. Due incidenza avversi, entrambi associati con l'anestesia locale ha portato ad un temporaneo gonfiore della lingua, ma risolto entro le prossime 48 ore senza effetti avversi. Se fatto correttamente, in condizioni sterili e atraumatici, questo metodo è sicuro ed efficace.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R21 DC03969-01 (a JGB). Ringraziamo il Dr. Fritz Lischka per l'acquisizione di singole cellule papille gustative, il Dott. Tauf Huque per l'esecuzione della RT-PCR Figura 4B e il Sig. D. Bayley e la signora S. Alarcon per assistenza tecnica. M. Pepino Yanina è un tipo supportato da una DA07313 NIDAT32 Washington University School of Medicine, St. Louis, MO (Cottler, LB PI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McPherson-Vannas. Curved, sharp cutting edge 5mm. Comb, tip width 0.2 mm overall length 3" | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5603, Roboz | |
| Small Dumont forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4915, Roboz |
References
- Breslin, P. A., Spector, A. C.
- Miller, I. Anatomy of the peripheral taste system. Handbook of Olfaction and Gustation. Doty, R. I., Dekker, M. , Marcel Dekker. New York. 521-547 (1995).
- Figure 12.67. Gray's Anatomy: The Anatomical Basis of Medicine and Surgery. , 38th Edition, Churchill Livingstone. New York. (1995).
- Huque, T., Cowart, B. J., Dankulich-Nagrudny, L., Pribitkin, E. A., Bayley, D. L., Spielman, A., Feldman, I., S, R., Mackler, Sour ageusia in two individuals implicates ion channels of the ASIC and PKD families in human sour taste perception at the anterior tongue. PLoS One. 4 (10), e7347-e7347 (2009).
- MacDonald, J. F., Mody, I., Salter, M. W., Spielman, A. I.
