Summary
Conocimiento de los mecanismos moleculares que subyacen en la transducción del gusto ha disfrutado recientemente de importantes avances, en gran parte debido al uso de modelos animales. Sin embargo, la gran diversidad en el sentido del gusto y la especificidad entre los órdenes de mamíferos estudios en el tejido humano. Se describe una técnica de biopsia para recoger las células vivas el sabor de las papilas de la lengua humana.
Abstract
El sentido del gusto es fundamental para la vida humana. Se informará al organismo acerca de la calidad de los alimentos que se ingieren y potencialmente estimula los procesos metabólicos que preparar el tubo digestivo para la digestión. Progreso constante se está avanzando hacia la comprensión de los acontecimientos a principios bioquímicos y moleculares que subyacen a la transducción de sabor (para una revisión, Breslin y Spector, 2008 1). Sin embargo, el progreso hasta la fecha ha resultado en gran medida de los modelos animales. Sin embargo, dado que las diferencias marcadas en la especificidad de los receptores y la densidad de receptores varían según las especies, la transducción de sabor humano sólo será entendido por el uso de tejidos humanos gusto. Aquí se describe una técnica de biopsia para recoger humanos papilas fungiformes, visibles como estructuras redondeadas de color rosa anterior, alrededor de 0,5 mm de diámetro, que contiene las papilas gustativas. Estas papilas biopsia se utilizan para varios propósitos, incluyendo el aislamiento de células viables de las papilas gustativas, hibridación in situ con la inmunohistoquímica, y, a través de técnicas de biología molecular, la identificación de nuevas proteínas específicas de sabor.
Protocol
1. Introducción y consideraciones generales
El procedimiento general consiste en anestesia local de un pequeño (1 cm 2) área de la superficie dorsal de la lengua anterior, seguido de la eliminación de un número (6-8) de fungiformes (sabor) papilas de la zona anestesiados utilizando una curva de primavera micro -Tijeras (McPherson-Vannas tipo SR # 5603, Roboz, Rockville, MD). El quitar las papilas fungiformes son de aproximadamente 0,25 mm 3 cada uno. Hay muy poco no papilas (sabor) tejido epitelial eliminado junto con cada papila. Nueva forma de papilas en esta zona después de 3 a 5 semanas y recuperar el funcionamiento papilas gustativas (Spielman y Marca, observaciones no publicadas). No hay ningún efecto apreciable en el sabor o el sabor de los alimentos después de la eliminación de esta pequeña cantidad de material gusto. De los estudios que han contado con las yemas gustativas individuales en el lenguaje humano adulto, se puede estimar que la lengua humana contiene aproximadamente 5.000 papilas gustativas. Nuestro procedimiento elimina la mayoría de entre 20 y 25 de estas papilas gustativas (en promedio, ~ 3.5 a 4 por papilas gustativas fungiformes papila en humanos) 2, o aproximadamente el 0,4% del total. Además no hay dolor asociado con la pérdida quirúrgica de este tejido. Uno se siente, por supuesto, un poco de dolor en el sitio de la inyección única, ya que la aguja entra en la lengua. Después de la anestesia haya pasado, no hay molestias de vez en cuando leves de menos de un día, pero este malestar es mucho menor que lo que uno experimenta cuando accidentalmente "morder" la lengua queridos.
En los últimos años hemos desarrollado un procedimiento alternativo que no incluye la anestesia. La técnica para la extirpación de tejido es idéntico para ambos. La única diferencia en el procedimiento es que el cirujano ya no se limita a un área de 1 cm de diámetro 2, donde se abordó la anestesia. En vez s / él puede elegir cualquier sitio en la superficie dorsal de la lengua, donde aparecen las papilas prominentes. El número total de papilas eliminado se limitan a 8.6 en ambas técnicas, con o sin anestesia Si se realiza correctamente, el malestar de la eliminación de 6-8 papilas gustativas fungiformes se considera un problema menor si se compara con el dolor asociado con la administración de anestesia local, un estudio general de las personas que se sometieron a ambos procedimientos, es decir, con y sin anestesia, mostró que una abrumadora mayoría de los sujetos se dispensaría sin anestesia local en todas las biopsias en el futuro. El cirujano que desarrolló esta técnica (AIS) y varios colegas impartido por el autor que realiza biopsias sin anestesia, lo han probado a sí mismos y dar testimonio de que el malestar es temporal y se considera menor que la de la lengua morderse. Finalmente, decenas de personas que accedieron a hacer una biopsia se les preguntó si estarían dispuestos a intentar la eliminación de una papilla sin anestesia y si lo juzgan a ser muy doloroso que se someten a anestesia, han acordado continuar con la eliminación de las papilas, sin anestesia.
Toda la biopsia no debe durar más de 5-10 minutos. Si la anestesia se emplea otros 2-3 minutos, se añade. La biopsia se realiza típicamente en horas de la mañana. Antes de la biopsia, los voluntarios se les instruye para comer una comida ligera dos horas antes de la hora de inicio programada. En la biopsia, el consentimiento informado se obtiene. Los criterios de exclusión en el momento de la biopsia incluyen personas con enfermedades crónicas graves, ya sea controlado por la medicación o no (por ejemplo, las enfermedades gastrointestinales, enfermedades neurodegenerativas, cáncer, discrasias sanguíneas, alergia a los anestésicos locales, etc) aquellos con frecuencia cardíaca mayor a 100 o menos de 60, presión arterial sistólica mayor de 145 o inferior a 100, la presión arterial diastólica mayor de 90 o menos de 60 años, y la opinión de que el cirujano que el sujeto puede participar en el estudio.
Por último, es importante tener en cuenta que el procedimiento de la biopsia debe llevarse a cabo en las mismas instalaciones donde el tejido se procesa para su examen ya la integridad del tejido se pierde rápidamente como lo hemos señalado con frecuencia por el deterioro de la calidad del ARNm. Para minimizar estos problemas, el tejido de la lengua debe ser procesada lo más rápido posible.
2. Preparación tema
- El sujeto está sentado en un sillón o una silla con un reposacabezas.
- Comprobar la frecuencia cardiaca y presión arterial en el momento de la biopsia. Caso de que el sujeto fuera del rango de la presión arterial, frecuencia cardiaca o la competencia oral, el cirujano recomienda que el tema que él / ella hacer una cita inmediata para ver a un médico.
- Inspeccionar la cavidad oral para la salud de los tejidos en general, con atención a los indicadores de la xerostomía, lengua geográfica o lesiones en la lengua. Cualquier sujeto con signos de enfermedad oral, incluyendo lesiones en la lengua o xerostomía se excluyeron del estudio. Instruir a los sujetos a enjuagar la boca con agua para eliminar todos los desperdicios del Cavit oralesy. Si es necesario la lengua se limpia con un raspador de lengua desechables para remover la placa y los residuos, lo que podría llevar a la lengua durante la inyección de la anestesia. El cirujano utiliza gasas estériles en una mano enguantada para mantener el ¼ anterior de la lengua que se extiende desde la cavidad oral.
- Si se utiliza anestesia, una jeringa de tuberculina de 1 cc con un calibre 28 x ½ "aguja que contiene 0,25 ml de lidocaína (2%) con epinefrina (1:100.000) se inyecta lentamente en un sitio justo debajo de la superficie dorsal de la porción anterior de la lengua . El sitio de la anestesia es distal al sitio de recolección para evitar la interferencia de la lidocaína con estudios posteriores. En comparación, la cantidad de lidocaína inyectada (0,25 ml) es de aproximadamente un cuarto de la cantidad normalmente para bloquear los nervios en los procedimientos dentales (0,8 ml a 1 ml). Después de la inserción de la aguja, pero antes de la inyección de la anestesia, la aspiración se asegura de que los vasos sanguíneos no se golpea. Esta precaución se toma a pesar de que es anatómicamente poco probable que un gran buque se golpeó cerca de la superficie dorsal. Las arterias sólo en la superficie dorsal, las arterias lingual dorsal son pequeños vasos sanguíneos localizados principalmente más por detrás de la tercera anterior, donde la recolección de tejidos se produce. Las grandes arterias lingual y las venas linguales se ejecutan en la superficie ventral de la lengua, muy lejos de la zona dorsal de recibir anestesia 3. El área de 1 cm anestesiados parece ser un poco pálido en comparación con el tejido circundante. Esto se debe a la inflamación de los tejidos, ya que comprime los vasos sanguíneos pequeños. También es debido al efecto vasoconstrictor de la epinefrina. Después de un minuto, una sonda se utiliza para probar el área de entumecimiento. Si el área no está adormecida, una segunda inyección (de 0,1 a 0,2 ml) se puede dar.
3. Papilas linguales técnica de extracción
- El cuarto anterior de la lengua de la asignatura se envuelve en una gasa estéril (Figura 1) y en la mano izquierda del cirujano (si se realiza la biopsia con la mano derecha). Una esquina de la gasa se deja abierta para permitir que el cirujano para limpiar la lengua sin saliva. La lengua debe mantenerse con firmeza, pero, por supuesto, no para causar molestias innecesarias. La punta del dedo índice de la mano izquierda se coloca debajo de la lengua directamente en el sitio donde se realiza la biopsia. Al pulsar con el dedo índice hacia arriba, la lengua se estira sobre la punta de los dedos haciendo las papilas palo hacia fuera para facilitar la biopsia.
- Criterios para la elección de las papilas de la biopsia: papilas gustativas son fácilmente distinguibles de los alrededores papilas filliform por su forma y tamaño. Las papilas fungiformes son redondos y algo aislado de los alrededores. En sus inmediaciones hay un espacio circular desprovista de filliform papilas (Figura 2A, flechas azules). Este espacio es de aproximadamente 1 mm de diámetro. Otra característica distintiva de las papilas fungiformes se extendió una arborización capilar visible en la parte superior de la mayoría de papilas fungiformes de los sujetos jóvenes. A pesar de arborización hace que la localización papilas fungiformes más fácil, que no necesariamente son buenos predictores de la existencia de las papilas gustativas en la que la papila. Como una regla comienza la cosecha hacia la parte delantera y se aleja de la punta de la lengua para evitar la hemorragia capilar de oscurecer el sitio de la colección de tejidos próximos.
- Una vez que una papila bien ha sido identificado, un resorte de micro-tijeras (McPherson-Vannas, borde curvo, de corte afilado de 5 mm, un peine, ancho de punta de 0,2 mm de longitud total de 3 "(RS-5603, Roboz) se utiliza para que le puede cortar. Para utilizar eficazmente las tijeras quirúrgicas micro no se debería utilizar la punta de la cuchilla para el corte, sino que, en la medida en el interior de la hoja como sea posible (Figura 1, la imagen ampliada y en la Figura 3), cerca del punto de intersección con la hoja opuesta. La eliminación de la papila se logra con el traslado de un corte de las tijeras (Figura 1). Cuanto más dentro de las hojas abiertas de la papila objetivo parece, la más eficaz es la de corte. Se debe tener cuidado de que la situación general de las tijeras deben ser paralelas con la superficie dorsal de la lengua.
- A veces la lengua se vuelve más seco que el cirujano está tratando de identificar una papila para su eliminación. Una vez seca, la capacidad del operador para ver con claridad que es una papilla fungiformes se hace más difícil y hace que el deslizamiento de las hojas sobre la papila muy difícil. Una lengua demasiado seco por lo general hace que el palo de la hoja de metal en la lengua de hacer el movimiento quirúrgica delicada menos controlables. Dejando el tema cerrar su / su boca y su saliva entrar en contacto con la superficie de la lengua facilita el proceso. Demasiado húmeda lengua tampoco es bueno. Usando el borde de la gasa que se utiliza para mantener la lengua ayuda en este proceso.
- Cualquier hemorragia capilar que ocurre es tratado por secante con una gasa estéril. El sangrado normalmente se detiene en un pocos minutos nutos y no interfiere con la recolección de tejido. Debido a que las papilas se extienden sobre la superficie del epitelio de la lengua, y sólo la parte superior 3 / 4 de una papila fungiformes se elimina (Figura 2B), que parte de la muestra papilas gustativas fungiformes, poco sangrado que se espera.
- Usando unas pequeñas pinzas Dumont (tipo de patrón), las papilas extraídas se colocan en una solución tampón enfriada timbre básico (130 mM NaCl, 5 KCl, 1 mM CaCl2, MgCl2 1 mM, 1 mM Na-piruvato, 20 mM HEPES-Na , pH 7,2; osmolalidad de ~ 305 osmols mili) para manipulaciones posteriores. Es imprescindible que nunca una pizca de la papila entre las aspas de un fórceps. El tejido es muy frágil y debe ser manejado con extremo cuidado.
- Después de la eliminación de las papilas, el tema permanece en la silla de diez a quince minutos. Cada tema se dijo que no se muerda la lengua anestesiada, sino para mantener su lengua en reposo. Los sujetos deben ser visualmente supervisado por el cirujano a cargo. La anestesia se espera que desaparezca en unos 30-60 minutos. Debido a que el sitio de la extracción papilas puede ser un poco dolorida después de la biopsia, se les enseña a ser conscientes de picante o caliente (la temperatura) de alimentos, bebidas gaseosas o bebidas que son extremadamente fríos o calurosos. Otra indicación proporcionada a los sujetos que cualquier ligera coloración rojiza de la saliva es normal y dejará tras la disolución del coágulo.
- Los sujetos se ven los 30-40 días después de la retirada de las papilas de la evaluación del sitio donde fueron retirados de las papilas. Por este papilas gustativas momento que lo han regenerado completamente.
5. Resultados representante
Tejidos recogidos pueden ser utilizados para inmunohistoquímica, RT-PCR, hibridación in situ, de imágenes de calcio, de sujeción de parches y cultivo de tejidos. Cuando se realiza correctamente la aparición de las papilas son de aspecto sano, blanco, de 0.5-1 mm de diámetro (Figura 2B).
Papilas recogidos por inmunohistoquímica son elaborados a base de protocolos existentes y publicados 4. Un brote del gusto típico de una papila gusto paraformaldehide fijo se muestra en la Figura 4.
Papilas biopsia también puede ser tratada enzimáticamente 5 para lograr la disociación de las células de las papilas gustativas. Después de la disociación enzimática, las células se pueden mantener hasta por 4 horas en una placa de Petri húmeda a 4 ° C. En este estado se puede utilizar para célula de PCR (Figura 4), Ca-imagen, etc
Las células muestran una variedad de formas, muchos de ellos delgados y bipolar (Figura 5A y 5B), como cabría esperar de una célula gustativa. Cuando la recolección de células o la realización de Ca-imagen, después de 20 minutos bajo un microscopio, las células comienzan a desarrollar ampollas de apoptosis (Figura 6A y 6B, flechas) y muchos de ellos se vuelven redondos. Usando una técnica desarrollada en nuestro laboratorio, las células fueron recogidas de forma individual mediante un parche pipeta, como se muestra en la Figura 5A y 5B.
Como se mencionó anteriormente, las papilas comienzan a crecer de nuevo después de 5 a 8 semanas. Figura 7 demuestra la aparición de una lengua, donde se eliminaron ocho papilas fungiformes de la lengua lado izquierdo de un voluntario sin usar anestesia. Aviso de 8 puntos tenue roja, donde se cortó las papilas fuera. No se observa sangrado después de la cirugía. La actual imagen fue tomada 10 minutos después de la biopsia. Figura 7B es una imagen de la lengua sobre el mismo tema visto 40 días después de la biopsia. Note que todos han vuelto a crecer papilas. Para determinar si las papilas regenerados son funcionales pedimos a nuestros voluntarios de acuerdo a una segunda biopsia que implique las papilas exactamente la misma. Para identificar correctamente las papilas apropiado que se piensa volver a la cosecha, se generó una cuadrícula (Figura 7) que se ajuste a las papilas 8 que se eliminaron en el primer lugar y superpuestas que sobre la lengua del mismo voluntario después de 40 días después de la biopsia inicial . Ayudado por el contorno de la lengua y la distancia desde el margen a la red, una vez identificados, hemos eliminado algunas de las papilas exactamente el mismo y se han elaborado para inmunohistoquímica. Figura 4 es una de estas papilas. Observe el esquema de una papila gustativa (en amarillo) y la tinción de la fosfolipasa inmunopositivas Cβ2 (PLCβ2), un tipo de dos células gustativas de transducción asociada a la enzima. Estos datos demuestran que el uso del procedimiento de la biopsia como se describe en este documento, las papilas fungiformes regenerar suficiente por 40 días para que también en el lugar probable paladar funcional.
Figura 1. El cuarto anterior de la lengua de la asignatura se envuelve en una gasa estéril y se mantiene en la mano izquierda del cirujano. La lengua se debe sujetar firmemente. La imagen ampliada de la derecha muestra la posición correcta de las tijeras y la posición de la papila en relación a la hoja.
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Figura 2. (A) las papilas fungiformes se muestran con flechas azules. Estas son estructuras redondas un poco aislado de su entorno y en sus inmediaciones hay un espacio circular carece de papilas filliform. (B) fungiformes papilas gustativas en la punta del muelle de micro-tijeras segundos después de que se ha eliminado.
Figura 3. Auto biopsia de una papila fungiformes utilizando un espejo y sin anestesia. El recuadro muestra la situación general de las tijeras, que debe ser paralela a la superficie dorsal de la lengua. Si se realiza correctamente y no traumática, la anestesia se renuncia por prácticamente todos los voluntarios.
Figura 4 A. Inmunohistoquímica de una papila gustativa. Una papilla fungiformes visualizado por la óptica Nomarski utilizando anticuerpos contra la fosfolipasa β2 y etiquetados con la proteína fluorescente de color rojo. El contorno de la yema del gusto y algunos etiquetados células gustativas se muestran en amarillo. 
B. RT-PCR del candidato a receptor del sabor amargo, ácido Sensing Ion Canal 1 (ASIC1). M = marcador. Calles 1 a 4 fueron célula RT-PCR para ASIC1 a partir de cuatro diferentes voluntarios. Después de la recolección, las papilas fungiformes se disociadas enzimáticamente, las células de forma individual recogido y expresión de ASIC1 se hace. Las calles 2 y 4 tuvieron expresión normal de ASIC1.
Figura 5. A. Imagen de las células gustativas solo se recogió con una pipeta de parches. Una de las células epiteliales grandes es visible en la esquina inferior izquierda (5A). Dos células rojas de la sangre también se pueden ver por encima de la pipeta de patch y detrás el cuerpo de vidrio. La célula gusto es de aproximadamente 30 a 50 micrones de largo y alrededor de 6 micras. Como referencia, un glóbulo rojo es de 7.8 micrones de diámetro. B. muestra otra célula del receptor gustativo rodeada por cuatro células epiteliales. La célula se ve nítido sabor.
Figura 6. A. Imágenes de células que se comenzó a desarrollar vesículas apoptóticas (fantasma como ampollas redondas unida a la célula gusto, flechas). Las células B. ya no se cosechan cuando su apariencia cambia como se muestra aquí.
Figura 7. A. Diez minutos después de la eliminación de papilas gustativas 8 sin usar anestesia. Los sitios quirúrgicos son visibles como manchas ligeramente rojizo. No se nota sangrado.
B. La lengua misma 40 días después de la biopsia. Aviso a todos papilas regenerado. Para ayudar a identificar las papilas eliminado como vuelven a crecer, una red se creó con el sitio en el cuadro del lado derecho y cambiado a lo largo de las papilas regenerada en la imagen de la izquierda.
C. Las papilas regenerado apareció en el mismo lugar. La recolección papilas de nuevo desde este grupo, seguido por inmunohistoquímica demostró que las papilas regenerado contenía células funcionales del gusto (Ver Figura 4).
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Discussion
Una ventaja notable a partir de células humanas es su especificidad. El procedimiento que se describe en detalle ofrece tejido de la lengua para el aislamiento de las células receptoras del gusto de los humanos. Estas células gustativas se puede utilizar para estudios moleculares, buscando descubrir las moléculas importantes para la transducción de la información del gusto, y para los estudios de imágenes de calcio que supervisan la actividad de células gusto a los estímulos. Además, el tejido de la lengua proporcionada por este procedimiento se pueden analizar con diversas técnicas como la inmunohistoquímica, hibridación in situ, y permite captar células individuales de procedimientos moleculares como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), incluyendo en tiempo real cuantitativo PCR de los organismos unicelulares. Dado que este procedimiento se puede realizar en personas cuyo sentido del gusto puede ser psicofísicamente evaluados antes de la biopsia, es posible obtener una imagen clara de los detalles moleculares responsables de alteraciones del gusto (por ejemplo, ver Huque et al. 2009). Este procedimiento de la biopsia permite la producción de una solución viable y metabólicamente preparación intacta sola célula enriquecido en las células de las papilas gustativas y por lo tanto la posibilidad de realizar grabaciones de patch clamp en estas células. Usando esta técnica, los estudios futuros no sólo puede aumentar nuestra comprensión de la transducción de sabor procesos únicos para el hombre, sino también descifrar los mecanismos moleculares que subyacen a las anomalías gusto en la enfermedad o la medicación inducida por los Estados y desarrollar regímenes para el tratamiento de estas anomalías.
Finalmente, los resultados de nuestras observaciones indican claramente que la presencia de los "agujeros", observa a menudo en estrecha papilas fungiformes de arborizaciones y generalmente se considera que los poros de las papilas gustativas, son, de hecho, no buenos predictores de la existencia de las papilas gustativas. Justo lo que la naturaleza de estos agujeros es, o qué funciones puede realizar, no lo sabemos.
En 8 años desde que iniciamos este procedimiento, en repetidas ocasiones hemos recogido de varias decenas de voluntarios más papilas gustativas 4000. Dos incidencia adversa, ambos asociados con la anestesia local dio lugar a una hinchazón temporal de la lengua, pero resuelto en las próximas 48 horas, sin efectos adversos. Si se hace correctamente, bajo condiciones estériles y no traumática, este método es seguro y eficaz.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH R21 DC03969-01 (a JGB). Agradecemos al Dr. Fritz Lischka para capturar solo las células de su paladar, el Dr. Tauf Huque para llevar a cabo la RT-PCR se muestra en la Figura 4B, y el Sr. D. Bayley y la Sra. S. Alarcón de asistencia técnica. M. Yanina Pepino es un compañero con el apoyo de un NIDAT32 DA07313 Washington University School of Medicine, St. Louis, MO (Cottler, LB, PI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McPherson-Vannas. Curved, sharp cutting edge 5mm. Comb, tip width 0.2 mm overall length 3" | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5603, Roboz | |
| Small Dumont forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4915, Roboz |
References
- Breslin, P. A., Spector, A. C.
- Miller, I. Anatomy of the peripheral taste system. Handbook of Olfaction and Gustation. Doty, R. I., Dekker, M. , Marcel Dekker. New York. 521-547 (1995).
- Figure 12.67. Gray's Anatomy: The Anatomical Basis of Medicine and Surgery. , 38th Edition, Churchill Livingstone. New York. (1995).
- Huque, T., Cowart, B. J., Dankulich-Nagrudny, L., Pribitkin, E. A., Bayley, D. L., Spielman, A., Feldman, I., S, R., Mackler, Sour ageusia in two individuals implicates ion channels of the ASIC and PKD families in human sour taste perception at the anterior tongue. PLoS One. 4 (10), e7347-e7347 (2009).
- MacDonald, J. F., Mody, I., Salter, M. W., Spielman, A. I.
