תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים
Summary
אנו מספקים פרוטוקול מפורט להכנת תאים ראשוניים ניתק מן<em> Drosophil</em> עוברים. היכולת לבצע את ההפרעות יעיל RNAi, יחד עם אחרים שיטות הדמיה מולקולרית, ביוכימיות תא תאפשר מגוון של שאלות להתייחס אליה<em> תסיסנית</em> תאים ראשוניים.
Abstract
כאן אנו מתארים שיטה להכנת ותאי culturing העיקרי ניתק מעוברים תסיסנית gastrula. בקיצור, כמות גדולה של עוברי מבוים מפני זבובים צעירים ובריאים נאספים, מעוקר, ולאחר מכן ניתק פיזית לתוך ההשעיה תא בודד באמצעות homogenizer זכוכית. לאחר מצופה על צלחות תרבות או שקופיות קאמרית בצפיפות המתאים בינוני תרבות, תאים אלה יכולים להתמיין עוד כמה סוגי תאים מורפולוגית-ברורים, אשר ניתן לזהות על ידי סמנים ספציפיים שלהם התא. יתר על כן, אנו מציגים תנאים לטיפול תאים אלה עם גדילי כפול (DS) RNAs לעורר מציאה גן. RNAi יעיל בתאים תסיסנית העיקרית נעשית פשוט על ידי רחצה התאים בינוני dsRNA המכילים תרבות. היכולת לבצע יעיל ההפרעות RNAi, יחד עם אחרים מולקולרית, מנתח ביוכימיים הדמיה התא, יאפשר מגוון של השאלות ייענו בתאים תסיסנית העיקרי, במיוחד אלה הקשורים שריר מבודל תאים עצביים.
Protocol
Discussion
דפוס התפתחותי של תרבויות העיקרי של תאים תסיסנית יכול להשתנות במידה רבה, ככל הנראה בשל מספר משתנים במהלך תהליך התא הראשוני הכנה. קודם כל, זבובים המשמשים להנחת ביצה צריך להיות צעיר (בתוך שבוע הישן) ובריא (ללא זיהום נגיפי או חיידקי). עוברים מופרית או נגוע יש להימנע, ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JB נתמכה על ידי דיימון רניון Cancer Research Foundation אחוות DRG-1716-1702. JZ נתמך על ידי NIH / NIGMS אחוות GM082174 F32-02. NP הוא חוקר של הווארד יוז רפואי במכון.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S3652 | ||
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | ||
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | I-6634 | ||
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | ||
| #25 US standard testing sieve | VWR | 57334-454 | ||
| #45 US standard testing sieve | VWR | 57334-462 | ||
| #120 US standard testing sieve | VWR | 57334-474 | ||
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR | 62400-620 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0040 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0100 | ||
| Costar, 384-well plate | VWR | 29444-078 | ||
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Laboratory culture of Drosophila. , 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
