Criopreservação e recuperação das células humanas iPS usando KnockOut Completa Feeder livre de substituição de soro Médio

Summary

Este protocolo descreve o procedimento detalhado para a criopreservação de células iPS humanas no meio de criopreservação KnockOut SR e recuperação destas células em completa KnockOut Feeder SR Free (KSR-FF) médio ou alimentação baseada em médias KnockOut SR.

Abstract

A descoberta em 2006 que fibroblastos humanos e mouse poderia ser reprogramado para gerar células iPS ^1-3 com qualidades muito semelhantes às células-tronco embrionárias criou uma valiosa fonte de novas células pluripotentes para descoberta de medicamentos, terapia celular, e pesquisa básica.

Media GIBCO e reagentes têm estado na vanguarda da pesquisa com células-tronco pluripotentes por anos. Knockout DMEM suplementado com Knockout Serum substituição é a mídia de sua escolha para o crescimento de células-tronco embrionárias e, agora, de cultura de células iPS ^3-9. Este padrão ouro sistema de mídia agora pode ser usado para alimentação livre de cultura com a adição de Knockout SR Cocktail Fator de Crescimento.

ES humana e métodos tradicionais de cultura de células iPS requerem o uso de mouse ou camadas de alimentação humana de fibroblastos, ou alimentador condicionado médio. Estes métodos cultura são de trabalho intensivo, difícil de escala e é difícil manter quadris células indiferenciadas, devido às condições indefinido. Invitrogen desenvolveu Knockout SR Cocktail Fator de Crescimento para permitir que você facilmente transição seus quadris e culturas de células-tronco embrionárias humanas para alimentação livre, mantendo o uso do SR Knockout.

Protocol

Nota: Para manter as condições de cultura estéril, todos os procedimentos neste protocolo são realizadas utilizando práticas de laboratório estéril e conduzidos sob uma capela de fluxo laminar.

Antes de começar, certifique-se que qualquer mídia é equilibrado a 37 ° C e adequadamente gaseados.

Preparar pratos Geltrex revestido Cultura

Nota: ver anexo para o uso de placas de cultura de CELLstart revestido.

1. Tubo de descongelar um dos Geltrex (1 mL) lentamente a 2-8 ° C e diluir 1:100 em 99 mL de Knockout D-MEM/F-12. Misturar a solução suavemente.
   
   Nota: Algumas linhagens de células iPS podem requerer uma diluição Geltrex diferentes para o crescimento ideal. Veja o apêndice para diluições de alternativa.
2. Cobrir toda a superfície de cada placa de cultura com a solução Geltrex (1 mL para um prato de 35 mm, 1,5 mL para um prato de 60 mm).
3. Seal cada prato com Parafilm para evitar a secagem e incubar os pratos para 1 hora a 37 ° C.
   
   Nota: Neste ponto, você pode armazenar os pratos Geltrex revestido cultura a 4 ° C por até 1 mês. Seal cada prato com Parafilm para impedir a Geltrex sequem.
4. Antes de usar, transferir os pratos Geltrex revestido a uma capela de fluxo laminar e permitir-lhes atingir a temperatura ambiente (cerca de 1 hora).

Preparando Alimentador-Free SR Completa KnockOut Médio

1. Para preparar 1 mL de 10 mcg / ml solução FGF Basic, assepticamente misturar os componentes listados abaixo. Alíquota da solução e armazenar a -20 ° C por até 6 meses.
   

   FGF básico	10 mg
   D-PBS	990μL
   10% BSA	10 L

   
   Nota: BSA pode ser substituído com HSA ou SR Knockout na mesma concentração.
2. Para preparar 50 mL de solução 2 Dispase mg / mL, assepticamente misturar os componentes listados abaixo. Filtro de esterilizar a solução e armazenar a 4 ° C por até duas semanas.

   Dispase	100 mg
   D-PBS	50 mL

3. Para preparar 100 mL de SR KnockOut completa Alimentador-Free (KSR-FF) assepticamente combinar os componentes listados na tabela abaixo.
   

   Componente	Concentração de ações	Concentração Final	Volume
   Knockout DMEM/F12 (Cat. n º. 12.660-012)	-	1X	76,8 mL
   Glutamax-I (Cat. No. 35050-061)	200 mM	2 mM	1 mL
   KnockOut SR (sem Cat.. 10.828-028)	-	20%	20 mL
   KnockOut SR-GFC (sem Cat.. A10580-01)	50X	1X	2 mL
   bFGF (Cat. n º. PHG0024).	10 mcg / mL	20 ng / mL	200 mL

   
   Você pode armazenar o meio KSR-FF a 2-8 ° C por até uma semana.
4. Pouco antes de pré-equilibrar o meio completo à temperatura e gases, adicionar assepticamente o volume necessário de 2-mercaptoetanol (55 mM de concentração de ações) para uma concentração de 0,1 mM final. Por exemplo, para preparar 100 mL da KSR-FMédio F adicionar 182 mL de 55 mM 2-mercaptoetanol (1:550 diluição) Alternativamente, o 2-mercaptoetanol podem ser adicionadas ao meio 1X preenchido e armazenado a 2-8 ° C por até uma semana.

Preparando congelamento / Criopreservação Médio

O meio de criopreservação consiste em dois meios de comunicação; Médio Congelamento A e B. Congelamento Médio Eles são adicionados às células em momentos diferentes e devem permanecer separados. Eles estão cada 50% do volume total de Medium Criopreservação necessário. O volume total de Medium Criopreservação necessário é 1 mL para cada frasco a ser congelados. Um prato de 90% confluentes 60mm de CTEh pode ser usado para o banco 2 frascos de CTEh na mídia criopreservação.

Prepare volume suficiente de cada meio de congelamento, com um extra de 2-5 mL para garantir excedente.

Congelamento Médio A (50% do volume final):	50% DMEM/F12	KSR 50%
Congelamento Médio B (50% do volume final):	80% DMEM/F12	20% DMSO

Exemplo:

Se você está congelando 20 frascos de células, você precisará de 20 mL de Criopreservação Médio. Adicionar 4 ml de sobrecarga para um total de Medium Criopreservação 24mL. Isso significa que você vai precisar de 12 ml Médio Congelamento A. (50% de 24mL) e 12 ml de B Freezing Medium (50% de 24mL)

Congelamento Médio A (12 ml):	6 mL DMEM/F12	6 mL KSR
Congelamento Médio B (12 mL):	9,6 mL DMEM/F12	2,4 mL DMSO

A composição final do Médio Criopreservação é de 65% DMEM/F12, KSR 25% e DMSO 10%.

Criopreservação iPSCs

1. Pré-aquecer o volume necessário de Dispase em um banho de água 37 ° C. Consulte a Tabela 1 abaixo para obter detalhes sobre os volumes necessários.
2. Pré-equilibrar o volume necessário de KSR-FF em um banho de água a 37 ° C for15 min. Consulte a Tabela 1below para obter detalhes sobre os volumes necessários.
3. Aspirar o meio de gastos do navio cultura usando uma pipeta, e lavar as células duas vezes com D-PBS.
4. Delicadamente adicionar pré-aquecido Dispase solução para o navio de cultura (por exemplo, 1 mL de solução Dispase por 60 mm placa de cultura). Redemoinho do navio cultura para revestir a superfície da célula inteira.
5. Incubar a embarcação cultura a 37 ° C por 3 minutos.
6. Remover o navio da incubadora, aspire a solução Dispase e lavar cuidadosamente as células com D-PBS.
7. Raspe as células da superfície da placa de cultura com uma espátula de células, e transferência das células para um tubo de centrifugação estéril 15ml.
8. Lavar o prato de cultura duas vezes com KSR-FF, gentilmente "pulverização off" as células que não tenham destacado. Piscina do enxágüe meio com as células no tubo de 15mL.
9. Centrifugar o tubo a 200 xg por 5 minutos em temperatura ambiente para agregar as células.
10. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular e descartá-lo.
11. Prepare uma quantidade suficiente de criotubos. Uma vez que as células estão em contato com DMSO, devem ser aliquotado e congelado dentro de 2-3 minutos.
12. Agite suavemente o tubo, para desalojar totalmente o pellet celular a partir do fundo do tubo e volte a suspender as células em A. Medium Congelamento [cuidado pipetando para cima e para baixo usando a 5 mL pipeta sorológica]. Após suspensão uniforme de aglomerados, adicionar igual volume de B Freezing Medium para ele, de uma forma sábia queda, enquanto gentilmente agitando o suspensão de células para misturar.
    
    Nota: Neste ponto, as células estão em contato com DMSO e trabalho deve ser realizado de forma eficiente. Uma vez que as células estão em contato com DMSO, devem ser aliquotado e congelado dentro de 2-3 minutos.
13. Ml 1 alíquota da suspensão de células em cada cryovial.
14. Rapidamente colocar os frascos em um Mr. Frosty [para congelar rapidamente] e transferi-lo para -80 ° C durante a noite.
15. Após o armazenamento durante a noite a -80 ° C, a transferência das células para um tanque de nitrogênio líquido para o armazenamento de longo prazo.

iPSC descongelar frasco e recuperação das células

Nota: KSR-FF pode ser substituído com KSR meio contendo MEF-condicionado, ou médio KSR para uso com alimentadores. Veja o apêndice para obter instruções para a preparação de meios de comunicação.

Pré-aquecer 10ml de KSR-FF médio em um tubo de 50 mL.

1. Equilibrar a quantidade adequada de Geltrex revestido pratos à temperatura ambiente e aspirar qualquer tipo de líquido a partir os pratos antes que você platingr células.
2. Remova cuidadosamente a CTEh (ou iPSC) frasco de Tanque de armazenamento de nitrogênio líquido.
3. Descongelar rapidamente frasco frozen de células em um banho de água 37 ° C, até que apenas um pequeno pedaço congelado permanece no frasco.
4. Pulverizador frasco com 70% isopropanol para descontaminar-lo e transferi-la para a capa estéreis de cultura de tecidos.
5. Transferir assepticamente todo o conteúdo do frasco em um tubo cônico de 15 mL utilizando uma pipeta de 5 mL.
6. Lavar o frasco com 1 mL de KSR-FF e adicione este ao tubo de centrifugação de 15 mL.
7. Lentamente, adicionar 4 mL da KSR-FF gota a gota, para as células no tubo de 15mL cônico. Ao adicionar o meio, gentilmente mova o tubo para trás e para misturar as células. (Isto reduz choque osmótico para as células).
8. Centrifugar o tubo de 15 mL com a suspensão de células em 1000rpm (200 x g) por 2 minutos em temperatura ambiente.
9. Aspirar cuidadosamente e descartar o sobrenadante sem perturbar o pellet celular.
10. Re-suspender o pellet celular pré-aquecido KSR-FF (por exemplo, prato 4mL/60 milímetros), utilizando uma pipeta de 5 mL e gentilmente pipeta as células para cima e para baixo até pellet celular está totalmente dispersa. A viabilidade de mais de 70% é esperado, no entanto, se a viabilidade é inferior a 70%, pode demorar mais tempo para as células para chegar a confluência.
11. Usando a mesma pipeta, transferir a suspensão celular gota a gota, a Geltrex revestido placa de cultura pré-equilibradas à temperatura ambiente.
12. Coloque o prato de cultura em uma incubadora de 37 ° C, com uma atmosfera húmida de 4 a 6% CO ₂ no ar. Cuidadosamente redemoinho em um navio norte a sul, de leste a oeste padrão para distribuir uniformemente as células.
13. Suavemente fluido mudar a placa de cultura de 24 horas pós-descongelamento, e depois diariamente para remover os restos celulares e para fornecer nutrientes fresco até que o prato é de aproximadamente 70-80% confluentes. Para a cultura e continuou passaging de células iPS seu, consulte nosso protocolo intitulado "Alimentador-Livre Cultura e Passaging das células humanas iPS usando Completa KnockOut substituição Feeder Serum-Free Medium"

Resultados esperados

As células devem ser cerca de 70-80% confluentes antes da criopreservação. Dispase resultados na digestão enrolando e dobrando das colônias ao longo das margens da colônia. Após a colheita as células são congeladas como pequenos aglomerados na mídia criopreservação. Uma vez que o frasco é descongelado, as células se recuperar e anexar o prato pré-revestidos como pequenos aglomerados. Eles crescem rapidamente levando a um prato confluentes em 5-6 dias.

Tabela 1 - Volumes recomendadas

Componente	Dish 35 milímetros	Dish 60 milímetros	Dish 100 milímetros
Completa KnockOut SR médio	2 mL	4 mL	10 mL
Geltrex Solution	1 mL	1,5 mL	4-5 mL
Dispase	0,5 mL	1 mL	ML 3-4
D-PBS para lavagem	2 mL	4 mL	10 mL

Por favor, clique aqui para ver o apêndice .

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nocaute DMEM/F12		12660-012	Nota: consulte o apêndice para o uso de produtos DMEM alternativos GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)
KnockOut Serum Replacement		10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		A10580-01
FGF-basic, proteína recombinante humana, 10 μ g		PHG0024	Nota: ver apêndice para tamanhos alternativos de embalagens de bFGF.
2-Mercapt– thanol		21985-023
Dispase		17105-041	Nota: veja o apêndice para métodos alternativos
de passagem Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		A10480-01
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (D-PBS) sem cálcio e magnésio		14190-144
DMSO, 500mL	JT Baker	JT9224-1
de capuz
ajustada em 37° C
Banho de Água com Pipeta Auxiliar
fixado em 37° C
Pipetas serológicas estéreis (5 ml, 10 ml)
Centrífuga
15 mL tubos
60 mm Placas
Tanque
Recipientes			para congelação de isopropanol
1,5 mL de criogeniais