De intens bestudeerde nematode worm<em> Caenorhabditis elegans</em> Kan transgenically worden gemanipuleerd om het menselijk β-amyloïd peptide (Aß) uit te drukken. Geïnduceerde expressie van Aß in<em> C. elegans</em> Spier leidt tot een snelle, reproduceerbare verlamming fenotype die gebruikt kan worden om behandelingen die Aß toxiciteit moduleren volgen.
Accumulatie van het β-amyloïd peptide (Aß) wordt algemeen aangenomen dat centraal staan in de inductie van de ziekte van Alzheimer, maar de relevante mechanisme (s) van de toxiciteit zijn nog onduidelijk. Aß is ook intramusculair gestort in Inclusion Body Myositis, een ernstige menselijke myopathie. De intens bestudeerde nematode worm Caenorhabditis elegans kan transgenically worden gemanipuleerd om de menselijke Aß uit te drukken. Afhankelijk van het weefsel of het tijdstip van Aß expressie, kunnen transgene wormen hebben gemakkelijk meetbaar fenotypen die dienen als een read-out van Aß toxiciteit. Bijvoorbeeld, transgene wormen met pan-Aß neuronale expressie gebreken vertonen is associatief leren (Dosanjh et al., 2009.), Terwijl transgene wormen met constitutieve spier-specifieke expressie vertonen een progressieve, leeftijd-afhankelijke verlamming fenotype (Link, 1995; Cohen et al. . 2006). Een bijzonder nuttige C. elegans model maakt gebruik van een temperatuurgevoelige mutatie in het mRNA surveillance systeem engineer temperatuur-induceerbare spieren de expressie van een transgen Aß, wat resulteert in een reproduceerbare verlamming fenotype af van de temperatuur opschakelen (Link et al.. 2003). Behandelingen die tegen Aß toxiciteit in dit model [bijv., expressie van een beschermende transgen (Hassan et al.. 2009) of blootstelling aan Ginkgo biloba extracten (Wu et al.. 2006)] reproduceerbaar de snelheid van verlamming veroorzaakt door de temperatuur opschakelen van deze transgene veranderen wormen. Hier beschrijven we ons protocol voor het meten van de snelheid van verlamming in deze transgene C. elegans model, met bijzondere aandacht voor experimentele variabelen die deze meting kunnen beïnvloeden.
Het protocol hebben we beschreven kan effectief worden gebruikt voor het testen van de effecten van de verbindingen op Aß toxiciteit. Gepubliceerd voorbeelden zijn de effecten van Ginkgo biloba-extract bestanddelen (Wu et al.. 2006) en reserpine (Arya et al.. 2009). Verbindingen die zijn beschermend tegen Aß toxiciteit bij andere systemen hebben ook aangetoond dat beschermende in dit model (bijv. memantine, onze niet-gepubliceerde resultaten). Een belangrijke reden voor de oprichting van dit model is dat de goed ontwikkelde genetische en moleculaire technieken beschikbaar zijn in C. elegans kan worden gebruikt om mechanismen van Aß toxiciteit te onderzoeken. Zo kunnen de effecten specifieke mutaties op de Aß toxiciteit worden getest (bv. een vermindering van de insuline-achtige signalering door de invoering van een daf-2 verlies-van-functie mutatie, Florez-McClure et al. 2007)., En dit model kan ook worden gebruikt om de effecten van de over-expressie transgenen (Fonte et al.. 2008) te onderzoeken. We hebben onlangs uitvoerig gebruik gemaakt van dit model om de effecten op toxiciteit van enkel aminozuur substituties in Aß (niet gepubliceerde data) te onderzoeken.
De transgene model hier beschreven analyses het effect van acute Aß expressie op spiercel functie. Op het moment van verlamming spiercellen en hun sarcomeer zijn intact, de verlamming fenotype is niet het gevolg van spier celdood. Echter, na verlamming (~ 48 uur na de eerste opschakelen) is er een afbraak van spieren integriteit en de uiteindelijke dood van de wormen. We hebben niet onderzocht die stroomafwaarts effect van Aß meningsuiting of gebruikten het als een toxiciteit marker.
De induceerbare Aß uitdrukking hier beschreven model is niet geschikt voor het onderzoeken van behandelingen die β-amyloïde formatie per se moduleren. Hoewel de transgene wormen met constitutieve Aß uitdrukking vorm gemakkelijk detecteerbaar amyloïd afzettingen (Fay et al., 1998;.. Link et al. 2001), transgene wormen met induceerbare Aß uitdrukking hebben zelden amyloid deposito's en de verlamming fenotype verschijnt onafhankelijk van amyloid depositie (Drake et al.. 2003). Onze resultaten komen overeen met de opvatting dat acute toxiciteit van Aß geïnduceerde expressie het gevolg van de accumulatie van oplosbare Aß oligomere, niet amyloïde afzetting.
The authors have nothing to disclose.
We willen graag de huidige en voormalige leden van de Link lab die heeft geholpen bij de ontwikkeling van de protocollen hier beschreven, met name Gin Fonte, die ontwikkelde de oorspronkelijke procedure bedanken. Dit werk werd ondersteund door awards van de NIH (AG12423) en de Alzheimer's Association (Zenith Award) om CDL
Reagents | Quantity/2L | Company/Catalogue # | Comments |
NaCl | 6g | Sigma-Aldrich / S9888 | |
Agar | 40g | Sigma-Aldrich / A7002 | |
Peptone | 5g | Sigma-Aldrich / P0556 | |
ddH2O | 2L | ||
1M CaCl2 | 2mL | 147.02mg/mL in ddH2O | |
Uracil | 2mL | 2mg/mL in ddH2O | |
Cholesterol | 2mL | 5mg/mL in ethanol (do not autoclave) | |
1M MgSO4 | 2mL | 246.5mg/mL in ddH2O | |
1M KPO4 | 50mL | 98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH | |
Erlenmeyer Flask | VWR |