Die intensiv studiert Fadenwurm<em> Caenorhabditis elegans</em> Kann transgen entwickelt werden, um die menschlichen β-Amyloid-Peptid (Aß) auszudrücken. Induzierte Expression von Aß in<em> C. elegans</em> Muskels führt zu einer schnellen und reproduzierbaren Lähmung Phänotyp, die verwendet werden, um Behandlungen, die Aß Toxizität modulieren überwacht werden können.
Akkumulation des β-Amyloid-Peptid (Aß) wird allgemein angenommen, eine zentrale Rolle bei der Induktion der Alzheimer-Krankheit, sondern den entsprechenden Mechanismus (s) der Toxizität sind noch unklar. Aß ist auch intramuskulär in Inclusion Body Myositis, eine schwere menschliche Myopathie hinterlegt. Die intensiv studiert Fadenwurm Caenorhabditis elegans kann transgen entwickelt werden, um menschliche Aß Ausdruck zu bringen. Je nach Gewebe-oder Timing der Aß Ausdruck können transgene Würmer leicht messbaren Phänotypen, die als read-out von Aß Toxizität dienen. Zum Beispiel haben transgene Würmer mit pan-neuronalen Aß Ausdruck Mängel ist assoziativen Lernens (Dosanjh et al 2009.), Während transgene Würmer mit konstitutiver Muskel-spezifische Expression zeigen eine progressive, altersabhängige Lähmung Phänotyp (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Eine besonders nützliche C. elegans Modell beschäftigt temperatursensitive Mutation in der mRNA-Surveillance-System auf Temperatur-induzierbaren Muskel Ausdruck einer Aß Transgen-Ingenieur, was zu einer reproduzierbaren Lähmung Phänotyp der Temperatur Hochschalten (Link et al. 2003). Behandlungen, die gegen Aß Toxizität in diesem Modell [z. B. Ausdruck einer schützenden Transgen (Hassan et al. 2009) oder durch Einwirkung von Ginkgo biloba-Extrakten (Wu et al. 2006)] reproduzierbar verändern die Rate der Lähmung durch die Temperatur Hochschalten dieser transgenen induzierten Würmer. Hier beschreiben wir unsere Verfahren zur Messung der Geschwindigkeit der Lähmung in diesem transgenen C. elegans-Modell, mit besonderem Augenmerk auf experimentellen Variablen, dass diese Messung beeinflussen können.
Das Protokoll wir beschrieben haben, können effektiv zum Testen der Auswirkungen von Verbindungen auf Aß Toxizität verwendet werden. Veröffentlicht Beispiele sind die Effekte von Ginkgo biloba-Extrakt Bestandteile (Wu et al. 2006) und Reserpin (Arya et al. 2009). Verbindungen, die Schutz gegen Aß Toxizität in anderen Systemen haben, haben auch gezeigt, dass sein Schutz in diesem Modell (zB Memantin, unsere unveröffentlichte Ergebnisse). Ein wichtiger Grund für die Erstellung dieses Modells ist, dass die gut entwickelten genetischen und molekularen Werkzeugen in C verfügbar elegans kann verwendet werden, um Mechanismen der Aß Toxizität untersucht werden. So können die Auswirkungen spezifischer Mutationen auf Aß Toxizität untersucht (zB den Effekt der Reduzierung Insulin-like-Signalisierung durch die Einführung einer daf-2 loss-of-function-Mutation, Florez-McClure et al. 2007), und dieses Modell kann auch verwendet werden, um die Auswirkungen der Überexpression Transgene (Fonte et al. 2008) zu untersuchen. Wir haben vor kurzem umfangreiche Verwendung dieses Modells gemacht, um die Auswirkungen auf die Toxizität der einzelnen Aminosäure-Substitutionen in Aß (unveröffentlichte Daten) zu untersuchen.
Die transgenen Modell hier beschriebenen Tests die Wirkung einer akuten Aß Ausdruck auf Muskel-Zell-Funktion. Zur Zeit der Lähmung Muskelzellen und deren Sarkomer sind intakt; die Lähmung Phänotyp ist nicht das Ergebnis einer Muskelzelle Tod. Doch nach der Lähmung (~ 48 Stunden nach der ersten Hochschalten) gibt es einen Abbau der Muskeln, Integrität und schließlich zum Tod der Würmer. Wir haben nicht diesen nachgeschalteten Wirkung von Aß Ausdruck untersucht oder verwendet es als eine Toxizität Marker.
Die induzierbare Aß Ausdruck hier beschriebene Modell ist nicht geeignet für die Untersuchung von Behandlungen, die β-Amyloid-Bildung per se modulieren. Obwohl transgene Würmer mit konstitutiver Aß Ausdruck Form leicht erkennbar Amyloid-Ablagerungen (Fay et al 1998;.. Link et al 2001), transgene Würmer mit induzierbarer Aß Ausdruck selten Amyloid-Ablagerungen und die Lähmung Phänotyp scheint unabhängig von Amyloid-Ablagerung (Drake et al. 2003). Unsere Ergebnisse stimmen mit der Auffassung, dass die akute Toxizität von induzierten Aß Ausdruck ergibt sich aus der Ansammlung von löslichem oligomeren Aß, nicht Amyloid-Ablagerung.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten die aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Link-Labor, die für die Protokolle dazu beigetragen, hier beschriebenen, insbesondere Gin Fonte, der das ursprüngliche Verfahren entwickelt danken. Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen von den NIH (AG12423) und der Alzheimer Association (Zenith Award) zu CDL unterstützt
Reagents | Quantity/2L | Company/Catalogue # | Comments |
NaCl | 6g | Sigma-Aldrich / S9888 | |
Agar | 40g | Sigma-Aldrich / A7002 | |
Peptone | 5g | Sigma-Aldrich / P0556 | |
ddH2O | 2L | ||
1M CaCl2 | 2mL | 147.02mg/mL in ddH2O | |
Uracil | 2mL | 2mg/mL in ddH2O | |
Cholesterol | 2mL | 5mg/mL in ethanol (do not autoclave) | |
1M MgSO4 | 2mL | 246.5mg/mL in ddH2O | |
1M KPO4 | 50mL | 98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH | |
Erlenmeyer Flask | VWR |