Vi presenterar en metod för att förbereda organotypic skivor mitt i dräktigheten musembryon för odling och tidsförlopp avbildning av perifera nerver utväxt.
För många ändamål är odling av musembryon ex vivo som organotypic skivor önskvärt. Till exempel använder vi en transgen mus linje (tauGFP) där förbättrad version av det grönt fluorescerande protein (EGFP) är enbart uttrycks i alla nervceller i att utveckla centrala och perifera nervsystemet 1, vilket gör det möjligt att både filma innervation av den forelimb och att manipulera denna process med farmakologiska och genetiska tekniker 2. Den mest kritiska parametern i den framgångsrika odling av sådan skiva kulturer är den metod som skivorna är beredda. Efter omfattande tester av en mängd olika metoder, har vi funnit att en vibratome är den bästa möjliga enheten till skiva embryon så att de rutinmässigt resultera i en kultur som visar lönsamheten under en period av flera dagar, och viktigast, utvecklas i en ålder -specifika sätt. För mitt i dräktigheten embryon omfattar detta normalt utväxt av spinal nerver från ryggmärgen och dorsalrotsganglier till sina mål i periferin och en korrekt bestämning av skelett-och muskelvävnad.
I detta arbete presenterar vi en metod för behandling av hela embryon av embryonala dag (E) E10 till E12 till 300 till 400 mikrometer skivor för odling i en vanlig vävnadsodling inkubator, som kan studeras i upp till två dagar efter skiva beredning. Avgörande för framgången med denna metod är att använda en vibratome att skära varje agaros-inbäddade embryo. Detta följs av odlingen av de skivor på Millicell insatser kultur membran placeras på en liten volym av medium, vilket resulterade i ett gränssnitt kultur teknik. En kull med ett genomsnitt på 7 embryon ger rutinmässigt minst 14 skivor (2-3 skivor av forelimb regionen per embryot), som varierar något beroende på ålder embryon samt tjockleken på skivorna. Cirka 80% av den odlade skivor visar nerv utväxt, som kan mätas througout den odling period 2. Representativa resultat genom att använda tauGFP musen linjen demonstreras.
I en omfattande jämförelse av metoder för att förbereda embryonala bit kultur mitt i dräktigheten musembryon (E10 – E12), har vi konstaterat att en vibratome producerar utan tvekan den mest tillförlitliga resultat med hänsyn till både den totala lönsamheten för kulturer och reproducerbarhet nerven utväxt mönster. Däremot beredd skivor med hjälp av en McIlwain vävnad chopper 3 visade sig vara helt inviable. Vi arbetar ursprungligen en giljotin metod 4, där en hel kull av embryon kan …
Författarna erkänner den ursprungliga källan för idén att utföra skiva kultur på musembryon 5. Vi vill tacka för Joachim Kirsch för generösa vetenskapligt stöd och Anna Degen för att agera som vår Gofer under filmningen. Detta arbete har finansierats av det tyska Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) och universitetet i Heidelberg (Excellence Cluster cellulära nät).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
HBSS 10x | GIBCO | 14180 | ||
Dissection tools | FST | various | ||
L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | ||
Whatmann paper | Whatman Int. | 3030917 | ||
Shortened firepolished pipettes | ||||
DMEM | GIBCO | 41966 | ||
FBS | GIBCO | 10270-106 | ||
Pen Strep | GIBCO | 15140 | ||
L-glutamine 100x | GIBCO | 25030 | ||
Vibratome | Microm International GmbH | HM 650 V | ||
Fluorescent microscope | Olympus | BX61WI | ||
analySIS | Soft Imaging System | |||
Millicell-CM inserts | Millipore | PICMORG 50 | ||
10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | ||
LOCTITE 406 | Henkel | 142580 | ||
Razor blades | Thermo Fisher | none | ||
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | ||
HEPES | Roth | 9105.2 | ||
Glucose | Sigma | G7021 | ||
x4 objective | Olympus | PL series | ||
x10 objective | Olympus | UPLFL –PH series | ||
Filter | Olympus | U-MNIBA2 | ||
CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | ||
Equipment for heated chamber | Leica | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |