Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células
Summary
Método confiável para altamente eficiente<em> In vitro</em> Expressão e de gravação eletrofisiológicas subseqüente de recombinação dos canais de íons nas culturas de células embrionárias do rim (HEK-293T).
Abstract
A expressão in vitro e em gravação eletrofisiológicas de recombinante dos canais de íons nas culturas de células embrionárias do rim (HEK-293T) é uma estratégia de pesquisa onipresente. HEK-293T células devem ser semeados em lamínulas de vidro com uma densidade baixa o suficiente para que eles não estão em contato uns com os outros, a fim de permitir a gravação eletrofisiológicas sem efeitos de confusão devido ao contato com as células adjacentes. Canais transfectadas também deve expressar com alta eficiência na membrana plasmática de células inteiras de gravação patch clamp de correntes detectável acima dos níveis de ruído. Canais iônicos heteróloga muitas vezes exigem longos períodos de incubação a 28 ° C após a transfecção, a fim de alcançar expressão membrana adequada, mas há um aumento na perda de células-lamela aderência e estabilidade da membrana, a esta temperatura. Para contornar esse problema, desenvolvemos uma estratégia otimizada para células HEK-293T transfecção e placa. Este método requer que as células transfectadas ser em uma confluência relativamente alto, e incubados a 28 ° C por diferentes períodos de incubação pós-transfecção para permitir a adequada expressão da proteína de canal iônico. Células transfectadas são então banhado em lamínulas de vidro e incubados a 37 ° C por várias horas, que permite a penhora de células rígidas para as lamelas e restabilização membrana. As células podem ser gravadas logo após o plaqueamento, ou podem ser transferidos para 28 ° C para a incubação mais. Nós achamos que a incubação inicial a 28 ° C, após a transfecção, mas antes do plaqueamento, é a chave para a expressão eficiente de canais de íons heteróloga que normalmente não expressam bem na membrana plasmática. Positivamente transfectadas, as células cultivadas são identificados por co-expressas ou eGFP eGFP expressa a partir de um vector bicistronic (por exemplo, pIRES2-EGFP) contendo o canal iônico recombinante cDNA logo acima de um local de entrada interna ribossomo e uma seqüência de codificação eGFP. Whole-cell patch clamp gravação requer equipamentos especializados, além da elaboração de eletrodos de registro polido e eletrodos em forma de L chão de vidro de borosilicato. A entrega da droga para estudar a farmacologia dos canais iônicos podem ser alcançados diretamente micropipetting drogas no prato de gravação, ou usando microperfusão ou sistemas de fluxo por gravidade que produzem fluxos ininterruptos de solução de drogas sobre as células gravadas.
Protocol
Discussion
Ser capaz de gravar toda célula correntes utilizando os protocolos descritos e soluções indica que a transfecção foi bem-sucedida e que o desejado dos canais de íon ou complexos de canal iônico estão presentes com quantidades significativas na membrana celular. Deve ser positivamente as células transfectadas (ie verde fluorescente), mas não têm correntes de gravação, tempo adicional a 28 ° C pode ser necessária para permitir a proteína de canal a ser devidamente embalados e inserida na membrana cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma subvenção de funcionamento Discovery para JDS da Ciências Naturais e Engenharia Research Council (NSERC) do Canadá, um NSERC Alexander Graham Bell Bolsas de Pós-Graduação no Canadá (doutorado) (para A. Senatore) ea Fundação do Coração e Derrame, Grant -In-Aid NA # 6284.
Materials
| Material | Company | Catalogue Number | Comment |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 – 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Zeiss Canada | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Microelectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , (2003).
- Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
