Stratégie de transfection optimisés pour l'expression et l'enregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T
Summary
Méthode fiable pour très efficace<em> In vitro</em> Expression et ultérieures enregistrement électrophysiologique de recombinaison canaux ioniques voltage-dépendants dans des cultures de cellules rénales embryonnaires humaines (HEK-293T).
Abstract
L'expression in vitro et l'enregistrement électrophysiologique de recombinaison canaux ioniques voltage-dépendants dans des cultures de cellules rénales embryonnaires humaines (HEK-293T) est une stratégie de recherche omniprésent. HEK-293T doivent être plaqués sur des lamelles de verre à densité assez faible de sorte qu'ils ne sont pas en contact les uns avec les autres afin de permettre l'enregistrement électrophysiologique sans effets confondants dus au contact avec les cellules adjacentes. Transfectées canaux doivent aussi exprimer avec une grande efficacité à la membrane plasmique des cellules entières d'enregistrement patch clamp des courants détectable au-dessus des niveaux de bruit. Canaux ioniques hétérologue exigent souvent longues périodes d'incubation à 28 ° C après transfection afin de parvenir à l'expression membranaire adéquat, mais il ya augmentation des pertes de cellules lamelle d'adhérence et stabilité de la membrane à cette température. Pour contourner ce problème, nous avons développé une stratégie optimisée pour transfecter et la plaque HEK-293T. Cette méthode nécessite que les cellules transfectées soit à un confluence relativement élevés, et incubés à 28 ° C pendant différentes périodes d'incubation post-transfection pour permettre l'expression d'ions suffisamment de protéines canal. Les cellules transfectées sont ensuite étalées sur des lamelles de verre et incubées à 37 ° C pendant plusieurs heures, ce qui permet la fixation des cellules rigides pour les lamelles et la restabilisation membrane. Les cellules peuvent être enregistrées peu après le placage, ou peuvent être transférées à 28 ° C pour incubation. Nous constatons que l'incubation initiale à 28 ° C, après transfection, mais avant le placage, est la clé pour l'expression efficace des canaux ioniques hétérologue qui normalement n'expriment pas ainsi à la membrane plasmique. Positivement transfectées, les cellules cultivées sont identifiés par co-exprimé eGFP ou EGFP exprimée par un vecteur bicistronique (par exemple pIRES2-EGFP) contenant les ADNc recombinants canal ionique juste en amont d'un site interne d'entrée du ribosome et une séquence de codage eGFP. Cellules entières d'enregistrement patch clamp nécessite un équipement spécialisé, plus la artisanat des électrodes d'enregistrement poli et électrodes de masse en forme de L à partir de verre de borosilicate. La livraison de drogue à l'étude de la pharmacologie des canaux ioniques peuvent être obtenus directement en micropipetage médicaments dans le plat d'enregistrement, ou en utilisant microperfusion ou des systèmes à écoulement par gravité qui produisent des flux ininterrompu de solution médicamenteuse sur les cellules enregistrées.
Protocol
Discussion
Etre capable d'enregistrer la cellule entière courants en utilisant les protocoles décrits et les solutions indique que la transfection a été un succès et que les canaux souhaités ioniques voltage-dépendants ou les complexes de canaux ioniques sont présents en quantités significatives à la membrane cellulaire. Si les cellules transfectées de façon positive (c.-vert fluorescent) mais pas les courants enregistrable, un délai supplémentaire à 28 ° C peut être nécessaire pour permettre la protéi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de fonctionnement découverte à partir du JDS sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada, du CRSNG Alexander Graham Bell Canada Bourses d'études supérieures (doctorat) (à A. Senatore) et la Fondation des maladies du cœur, Grant -in-aid NA # 6284.
Materials
| Material | Company | Catalogue Number | Comment |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 – 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Zeiss Canada | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Microelectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , (2003).
- Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
